Un biosensor electroquímico portátil para el seguimiento de metabolitos y nutrientes.

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Aug 31, 2023

Un biosensor electroquímico portátil para el seguimiento de metabolitos y nutrientes.

Nature Biomedical Engineering volumen 6, páginas 1225–1235 (2022)Cite este artículo 74k Accesos 84 Citas 282 Detalles de Altmetric Metrics Biosensores no invasivos portátiles para el monitoreo continuo

Nature Biomedical Engineering volumen 6, páginas 1225–1235 (2022)Cite este artículo

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84 citas

282 altmétrico

Detalles de métricas

Los biosensores no invasivos portátiles para el seguimiento continuo de los metabolitos en el sudor pueden detectar algunos analitos en concentraciones suficientemente altas, normalmente durante el ejercicio vigoroso, para generar una cantidad suficiente de biofluido. Aquí informamos el diseño y el rendimiento de un biosensor electroquímico portátil para el análisis continuo, en el sudor durante el ejercicio físico y en reposo, de niveles traza de múltiples metabolitos y nutrientes, incluidos todos los aminoácidos y vitaminas esenciales. El biosensor consta de electrodos de grafeno que pueden regenerarse repetidamente in situ, funcionalizarse con polímeros impresos molecularmente similares a anticuerpos específicos de metabolitos y nanopartículas reporteras activas redox, e integrarse con módulos para la inducción del sudor basado en iontoforesis, muestreo de sudor con microfluidos, procesamiento de señales y calibración y comunicación inalámbrica. En voluntarios, el biosensor permitió monitorizar en tiempo real la ingesta de aminoácidos y sus niveles durante el ejercicio físico, así como evaluar el riesgo de síndrome metabólico (mediante la correlación de los niveles de aminoácidos en suero y sudor). El seguimiento de metabolitos para la identificación temprana de condiciones de salud anormales podría facilitar las aplicaciones en nutrición de precisión.

Los nutrientes circulantes son indicadores esenciales para la salud general y el funcionamiento del cuerpo1. Los aminoácidos (AA), que provienen de la ingesta dietética y la síntesis de la microbiota intestinal, y que están influenciados por los estilos de vida personales, son biomarcadores importantes para una serie de condiciones de salud (Fig. 1a)2. Los aminoácidos de cadena ramificada elevados (BCAA), incluida la leucina (Leu), la isoleucina (Ile) y la valina (Val), están asociados con la obesidad, la resistencia a la insulina y el riesgo futuro de diabetes mellitus tipo 2 (DM2) y enfermedades cardiovasculares (ECV). y cáncer de páncreas3,4,5. Las deficiencias de AA (por ejemplo, arginina y cisteína) podrían obstaculizar el sistema inmunológico al reducir la activación de las células inmunitarias6. El triptófano (Trp), la tirosina (Tyr) y la fenilalanina (Phe) son precursores de los neurotransmisores serotonina y catecolaminas (dopamina, norepinefrina y epinefrina), respectivamente, y desempeñan un papel importante en el funcionamiento de sistemas neuronales complejos y en la salud mental7,8. Varias huellas metabólicas (incluidas Leu, Phe y vitamina D) están relacionadas con la gravedad de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19)9,10. Las disparidades de salud en nutrición también se correlacionan bien con las alarmantes disparidades raciales y étnicas que empeoran por la vulnerabilidad y la mortalidad de la COVID-1911. Además, la disfunción de órganos y tejidos inducida por el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo podría resultar en una mayor incidencia de enfermedades cardiometabólicas12.

a, Los nutrientes circulantes, como los AA, están asociados con diversas condiciones fisiológicas y metabólicas. b, Esquema del 'NutriTrek' portátil que permite el monitoreo metabólico a través de una fusión sinérgica de LEG, RAR y anticuerpos artificiales. c, d, Esquema (c) y ensamblaje de capas (d) del parche de microfluidos 'NutriTrek' para la inducción, muestreo y biodetección del sudor. T, temperatura. e,f, Imágenes de un parche sensor flexible (e) y un sistema portátil con interfaz cutánea (f). Barras de escala, 5 mm (e) y 2 cm (f). g, Diagrama de bloques del sistema electrónico de 'NutriTrek'. Los módulos marcados con guiones rojos están incluidos en la versión de reloj inteligente. CPU, unidad central de procesamiento; POT, potenciometría; In-Amp, amplificador de instrumentación; MCU, microcontrolador; TIA, amplificador de transimpedancia; IP, iontoforesis; CE, contraelectrodo; RE, electrodo de referencia; NOSOTROS, electrodo de trabajo. h, Aplicación móvil personalizada para seguimiento metabólico y nutricional en tiempo real. i, reloj inteligente 'NutriTrek' con un parche sensor desechable y una pantalla electroforética. Barras de escala, 1 cm (arriba) y 5 cm (abajo).

El perfil metabólico y la monitorización son un enfoque clave para permitir una nutrición y una medicina de precisión13. Los estándares de oro actuales en evaluación médica y pruebas metabólicas dependen en gran medida de análisis de sangre que son invasivos y episódicos, que a menudo requieren visitas físicas a instalaciones médicas, procesamiento y almacenamiento de muestras que requieren mucha mano de obra e instrumentación delicada (por ejemplo, cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC). –MS))14. Dado que la actual pandemia de COVID-19 sigue sin control en todo el mundo, existe una necesidad apremiante de desarrollar sensores portátiles y de telemedicina para monitorear el estado de salud de un individuo y permitir una intervención oportuna en entornos domésticos y comunitarios15,16,17,18. 19,20,21,22,23; También es cada vez más importante monitorear el estado de salud cardiometabólico y nutricional a largo plazo de una persona después de recuperarse de una infección grave por COVID-19 utilizando dispositivos portátiles para capturar signos tempranos de posibles complicaciones endocrinológicas como la DM212.

El sudor es un fluido corporal importante que contiene una gran cantidad de sustancias químicas que reflejan las condiciones nutricionales y metabólicas24,25,26,27. La progresión de los análisis de sangre a los análisis de sudor portátiles podría ofrecer un gran potencial para la monitorización continua y no invasiva de biomarcadores fisiológicos críticos para la salud humana28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38. Sin embargo, los sensores electroquímicos portátiles actualmente informados se centran principalmente en un número limitado de analitos, incluidos electrolitos, glucosa y lactato, debido a la falta de una estrategia de monitoreo continuo adecuada más allá de los electrodos enzimáticos y selectivos de iones o la oxidación directa de moléculas electroactivas25,26,27. 34,35,36,37,38,39,40. Por lo tanto, la mayoría de los nutrientes y metabolitos clínicamente relevantes en el sudor rara vez se exploran y son indetectables mediante las tecnologías de detección portátiles existentes. Además, los biosensores portátiles actuales suelen requerir ejercicio vigoroso para acceder al sudor; aunque algunos informes recientes utilizan la iontoforesis basada en gel de pilocarpina para el muestreo de sudor sedentario22,30,36, este enfoque adolece de períodos cortos de sudor y baja precisión de detección debido a la mezcla de sudor y líquido de gel y la falta de muestreo dinámico del sudor.

En este artículo, presentamos una estrategia universal de biodetección portátil basada en una combinación juiciosa de grafeno grabado con láser (LEG) producible en masa, nanoinformadores activos redox (RAR) sintetizados electroquímicamente y anticuerpos artificiales basados ​​en polímeros impresos molecularmente (MIP). ', así como tecnologías únicas de calibración y regeneración in situ (Fig. 1b). A diferencia de los sensores de bioafinidad basados ​​en anticuerpos o MIP clásicos, que generalmente son de uso único y requieren múltiples pasos de lavado para transducir las interacciones de bioafinidad en soluciones iónicas estándar41,42, este enfoque permite la demostración de sensores de bioafinidad sensibles, selectivos y continuos. monitoreo de una amplia gama de biomarcadores a nivel de trazas en biofluidos, incluidos los nueve AA esenciales, así como vitaminas, metabolitos y lípidos que se encuentran comúnmente en el sudor humano (Tabla complementaria 1). La integración perfecta de este enfoque único con el procesamiento de señales in situ y la comunicación inalámbrica conduce a una poderosa tecnología portátil de detección de sudor, 'NutriTrek', que es capaz de realizar un monitoreo metabólico y nutricional personalizado y no invasivo para una intervención oportuna (Fig. 1b). La incorporación de la inducción del sudor basada en la iontoforesis de carbacol y el muestreo eficiente del sudor circundante basado en microfluidos permite un análisis molecular continuo, autónomo y prolongado con alta resolución temporal y precisión en todas las actividades, durante el ejercicio físico y en reposo. Utilizando cinco AA esenciales o condicionalmente esenciales (es decir, Trp, Try y tres BCAA (Leu, Ile y Val)) como nutrientes ejemplares, corroboramos el sistema en varios ensayos en humanos al inscribir tanto a sujetos sanos como a pacientes para un seguimiento personalizado de la fatiga central. , ingestas dietéticas estándar, estado nutricional, riesgos de síndrome metabólico y gravedad de la COVID-19.

El parche sensor flexible y desechable consta de dos electrodos de iontoforesis cargados con carbacol, un módulo de microfluidos de entrada múltiple, una matriz de sensores de nutrientes MIP multiplexados, un sensor de temperatura y un sensor de electrolitos (Fig. 1c-f y Fig. 1 complementaria). Todos los diseños de sensores y electrodos flexibles se basan en LEG, que tiene una gran superficie, excelentes propiedades electroquímicas y se puede producir a gran escala directamente sobre un sustrato de poliimida (PI) mediante grabado con láser de CO2 (Figura complementaria 2). El parche del sensor se puede unir fácilmente a la piel con contacto conformado e interfaces con un módulo electrónico miniaturizado para control de iontoforesis bajo demanda, procesamiento de señales in situ y comunicación inalámbrica con las interfaces de usuario a través de Bluetooth (Fig. 1g y Figs. complementarias 3 y 4). ). Se desarrolló una aplicación móvil personalizada 'NutriTrek' para procesar, mostrar y almacenar la información metabólica dinámica monitoreada por los sensores portátiles (Fig. 1h y Video complementario 1). El sistema portátil también se integró en un reloj inteligente con una pantalla de papel electrónica (Fig. 1i y Fig. complementaria 5).

La detección universal de AA y otros metabolitos/nutrientes con alta sensibilidad y selectividad se logró mediante un diseño cuidadoso de la capa MIP de unión selectiva en la LEG. Los MIP son receptores sintetizados químicamente que se forman polimerizando monómeros funcionales con moléculas plantilla. Aunque la tecnología MIP se ha propuesto para detección, separación y diagnóstico42,43, aún no se ha demostrado para la detección portátil continua, ya que los sensores MIP clásicos requieren pasos de lavado para la regeneración del sensor y la detección generalmente se realiza en soluciones tampón estándar o redox. En nuestro caso, el monómero funcional (por ejemplo, pirrol) y el reticulante (por ejemplo, APBA) forman inicialmente un complejo con la molécula diana; después de la polimerización, sus grupos funcionales están incrustados en la estructura polimérica de la LEG; La extracción posterior de las moléculas objetivo revela sitios de unión en el electrodo LEG-MIP que son complementarios en tamaño, forma y carga con respecto al analito objetivo (Figura 6 complementaria). Se diseñan dos estrategias de detección, directa e indirecta, sobre la base de las propiedades electroquímicas de las moléculas objetivo (Fig. 2). Las optimizaciones y caracterizaciones de los sensores LEG-MIP se detallan en la Nota complementaria 1 y en las Figs. complementarias. 7–13.

a, Detección directa de moléculas electroactivas mediante sensores LEG-MIP. b, c, voltamogramas DPV de los sensores LEG-MIP para la detección directa de Tyr (b) y Trp (c). Insertos, gráficos de calibración con ajuste lineal. ∆J, densidad de corriente de altura máxima. d, Detección y regeneración continua in situ de un sensor LEG-MIP Trp en 50 µM Trp. e, Detección molecular indirecta utilizando sensores LEG – RAR – MIP. f, voltamogramas LSV de detección indirecta de Leu con sensores LEG – PBNP – MIP. Recuadro, gráfico de calibración con ajuste lineal. g, h, Detección indirecta de todos los AA esenciales (g) y múltiples vitaminas, lípidos y metabolitos (h) utilizando sensores LEG-PBNP-MIP. Las líneas discontinuas representan líneas de tendencia de ajuste lineal. VC, vitamina C; VB6, vitamina B6; VD3, vitamina D3; VE, vitamina E. i, Esquema de sensores AA multi-MIP. j, voltamogramas LSV de un sensor multi-MIP LEG para la cuantificación de BCAA. Recuadro, gráfico de calibración con ajuste lineal. k, Detección y regeneración continua in situ de un sensor Leu LEG – PBNP – MIP en Leu 50 µM. l, Exploraciones CV repetitivas de un electrodo LEG-PBNP en KCl 0,1 M. m, voltamogramas DPV de detección indirecta de Leu con sensores LEG – AQCA – MIP. Recuadro, el gráfico de calibración. n, Regeneración in situ de un sensor LEG-AQCA-MIP Leu en una muestra de sudor crudo. o, Selectividad de los sensores Trp, Tyr, Leu, Ile, Val y BCAA frente a otros AA. p, Validación de sensores Tyr, Trp y Leu para analizar muestras crudas de sudor de ejercicio (n = 20) frente a GC-MS. Todas las barras de error representan la desviación estándar (sd) de tres sensores.

Para las moléculas electroactivas en el sudor, la oxidación de las moléculas objetivo unidas en la plantilla MIP se puede medir directamente mediante voltamperometría de pulso diferencial (DPV), en la que la altura máxima de la corriente se correlaciona con la concentración del analito (Fig. 2a). Teniendo en cuenta que se pueden oxidar múltiples moléculas electroactivas a potenciales similares, este enfoque LEG-MIP aborda cuestiones tanto de sensibilidad como de selectividad. Por ejemplo, Tyr y Trp, dos AA con potenciales redox cercanos (~ 0,7 V), podrían detectarse selectivamente con esta estrategia (Fig. 2b, cy Fig. 14 complementaria). Se observaron relaciones lineales entre las densidades de corriente de altura máxima y las concentraciones objetivo con sensibilidades de 0,63 µA µM-1 cm-2 y 0,71 µA µM-1 cm-2 respectivamente para los sensores LEG-MIP Tyr y Trp (Figura complementaria 15). Vale la pena señalar que la elección de las proporciones de monómero/reticulante/plantilla y los períodos de incubación tienen influencias sustanciales en la respuesta del sensor, mientras que el volumen de la muestra no (Figura complementaria 10). Los sensores Tyr y Trp se pueden regenerar fácil y repetidamente in situ sin ningún paso de lavado con una corriente-tiempo (IT) de amperometría de alto voltaje que oxida los objetivos unidos en sus potenciales redox (Fig. 2d).

Como la mayoría de los metabolitos y nutrientes (por ejemplo, BCAA) no son electroactivos y no pueden oxidarse fácilmente en condiciones operativas, en este documento utilizamos un enfoque de detección indirecta que involucra una capa RAR intercalada entre las capas LEG y MIP para permitir una cuantificación rápida (Fig. .2e). La adsorción selectiva de las moléculas objetivo sobre la capa polimérica impresa disminuye la exposición del RAR a la matriz de la muestra. Se pueden aplicar técnicas voltamétricas de potencial controlado como DPV o voltametría de barrido lineal (LSV) para medir el pico de oxidación o reducción del RAR, donde la disminución en la densidad de corriente de altura del pico corresponde a un aumento en los niveles de analito. Por ejemplo, utilizando nanopartículas de azul de Prusia (PBNP) como RAR (Fig. 11 complementaria), desarrollamos un sensor MIP-LEG Leu con una relación log-lineal entre la disminución de la altura del pico y la concentración de Leu y una sensibilidad de 702 nA mm- 2 por década de concentración (Fig. 2f). Establecimos este enfoque para cuantificar el rango fisiológicamente relevante de los nueve AA esenciales (es decir, Leu, Ile, Val, Trp, Phe, histidina (His), lisina (Lys), metionina (Met) y treonina (Thr)) ( Fig. 2g y Fig. Suplementaria 16), así como una serie de vitaminas, metabolitos y lípidos (vitaminas B6, C, D3 y E, glucosa, ácido úrico, creatina, creatinina y colesterol) (Fig. 2h y Fig. Suplementaria 17). ). Además de estos nutrientes y metabolitos, este enfoque se puede reconfigurar fácilmente para permitir el seguimiento de un amplio espectro de biomarcadores que van desde hormonas (por ejemplo, cortisol) hasta fármacos (por ejemplo, ácido micofenólico, fármaco inmunosupresor) (Figuras complementarias 18 y Tablas complementarias 2 y 3). La mayoría de estos objetivos son indetectables continuamente por cualquier tecnología portátil existente. Teniendo en cuenta que un nivel total de múltiples nutrientes (por ejemplo, BCAA totales) es a menudo un indicador de salud importante, se puede utilizar un enfoque MIP de plantillas múltiples para permitir una detección precisa y sensible de la concentración total de múltiples objetivos con un solo sensor (Fig. .2i,j). Estos sensores indirectos LEG-RAR-MIP se pueden regenerar in situ aplicando un potencial constante al electrodo de trabajo, que repele las moléculas objetivo unidas de la capa MIP, logrando una reutilización prolongada (Fig. 2k).

Los sensores LEG-MIP muestran respuestas estables durante el uso repetitivo: el RAR basado en PBNP mostró señales redox estables a lo largo de 60 exploraciones de voltamperometría cíclica (CV) repetitivas (Fig. 2l y Fig. complementaria 11); se observaron cambios mínimos en la producción durante un período de almacenamiento de 42 días (Figuras complementarias 19a, b); los sensores tampoco mostraron ningún cambio relativo sustancial de la señal cuando se usaron continuamente durante 5 días (Figura complementaria 19c). En comparación con los procesos tradicionales de preparación de MIP, la capa de MIP electrodepositada en la LEG producible en masa conduce a una alta reproducibilidad en selectividad, sensibilidad y consistencia entre dispositivos (Figuras complementarias 20 y 21). La elección de LEG como sustrato de deposición de MIP también mostró ventajas en la sensibilidad del sensor en comparación con los electrodos clásicos, como el electrodo de carbón vítreo, el electrodo de carbón impreso y el electrodo de Au (Figura complementaria 22). Otros RAR, como el ácido antraquinona-2-carboxílico (AQCA), también se pueden usar para la detección indirecta de AA con un rendimiento estable (aquí se usó DPV escaneado negativamente para monitorear la reducción de AQCA) (Fig. 2m y Fig. complementaria 23). Como se ilustra en la Fig. 2n, los sensores LEG-AQCA-MIP podrían regenerarse directamente en una muestra de sudor humano sin procesar, resolviendo uno de los principales cuellos de botella de los biosensores portátiles. Los sensores MIP-LEG AA tienen una excelente selectividad para otros analitos en el sudor (incluidos los AA con estructuras similares) en concentraciones fisiológicamente relevantes (Fig. 2o, Fig. 24 complementaria y Tabla complementaria 3). La tecnología LEG-MIP mostró una sensibilidad comparable con el actual estándar de oro GC-MS44 de laboratorio (Figura complementaria 25); Las mediciones del sensor en muestras de sudor humano sin procesar se han validado frente a GC-MS (Fig. 2p y Figs. complementarias 26 y 27).

Para permitir el monitoreo metabólico y nutricional continuo en el cuerpo, el parche sensor flexible fue diseñado para comprender un módulo de iontoforesis para la inducción localizada del sudor bajo demanda, un módulo de microfluidos de múltiples entradas para un muestreo eficiente del sudor, una matriz múltiple de sensores de nutrientes del sudor LEG-MIP para análisis continuo de AA, y sensores de temperatura y electrolitos basados ​​en LEG para la calibración del sensor AA en tiempo real (Fig. 3a). A diferencia de la detección clásica de sensores de bioafinidad en soluciones tampón o redox, el análisis del sudor in situ plantea más desafíos debido a la composición del sudor compleja e interpersonalmente variada y exige innovaciones tecnológicas para una detección corporal precisa. Por ejemplo, para la detección directa de LEG-MIP Trp, una exploración DPV en el sudor incluso antes del reconocimiento del objetivo/MIP podría provocar un pico de oxidación, ya que una pequeña cantidad de moléculas electroactivas (por ejemplo, Trp y Tyr) pueden oxidarse en la superficie de capa MIP; después del reconocimiento y unión de Trp en las cavidades MIP, se puede obtener una altura de pico de corriente sustancialmente mayor; medir la diferencia de las dos alturas de los picos permite una medición más precisa de la Trp unida directamente en el sudor con alta selectividad (Fig. 3b-d). La influencia de la temperatura y la fuerza iónica en los sensores AA se puede calibrar en tiempo real sobre la base de las lecturas de un sensor de temperatura resistente a la tensión basado en LEG y un sensor de Na+ selectivo de iones (Fig. 3e y Fig. complementaria 28). . Teniendo en cuenta que se informó que la tasa de sudoración durante el ejercicio influye en ciertos niveles de biomarcadores, podríamos usar el nivel de Na+ en el sudor (que mostró una correlación lineal con la tasa de sudoración) para calibrar aún más los niveles de nutrientes para un análisis personalizado. Esta estrategia de transducción única que involucra tanto las exploraciones DPV de dos pasos como las calibraciones de temperatura/electrolitos nos permite obtener lecturas precisas de forma continua en el sudor durante el uso corporal (Figura complementaria 29).

a, Ilustración de un parche de sensor portátil multifuncional. ISE, electrodo selectivo de iones. b – d, La estrategia de calibración de sensores de dos escaneos que permite la detección selectiva de Trp in situ en presencia de Tyr. ∆I, corriente de altura pico; ∆I′, diferencia de altura máxima causada por el reconocimiento del objetivo. Las curvas sólidas y discontinuas en c y d representan líneas de tendencia de ajuste lineal. e, Calibración de electrolitos de la lectura del sensor AA, con ajuste lineal. f, Esquema de muestreo de sudor localizado basado en extracción iontoforética de sudor con agentes muscarínicos: pilocarpina y carbacol. g, h, tasas de sudoración localizadas medidas en las áreas de piel estimuladas (g) y circundantes (h) después de una iontoforesis de 5 minutos con pilocarpina y carbacol. Las curvas sólidas y discontinuas representan líneas de tendencia de ajuste cuadrático. S, sujeto. i, Distribuciones de concentración de Trp simuladas numéricamente ([Trp]) en el depósito de microfluidos a los 120 s después de que el fluido de entrada cambió de 20 a 80 µM de Trp (caudal de 1,5 µl min-1) (con diseños variados en número de entrada, amplitud de ángulo, y orientación de entrada y salida). j, Evaluación corporal del parche de microfluidos flexible optimizado para una inducción eficiente del sudor iontoforético a base de carbacol y muestreo circundante en reposo. Las marcas de tiempo representan el período (min) después de una sesión de iontoforesis de 5 minutos. Se utilizó tinte negro en el depósito para facilitar la visualización directa del flujo de sudor en los microfluidos. Barra de escala, 3 mm.

Para que esta tecnología portátil sea ampliamente aplicable, particularmente para personas sedentarias, utilizamos aquí un módulo de iontoforesis diseñado a medida que consta del ánodo y el cátodo LEG junto con hidrogeles que contienen el agente muscarínico carbacol (carbagel) para la extracción sostenible del sudor. El carbacol se seleccionó entre varios agentes muscarínicos, ya que permite la secreción de sudor más eficiente, repetible y duradera de la glándula sudorípara circundante debido a sus efectos nicotínicos adicionales45 (Fig. 3f-h, Fig. complementaria 30 y Nota complementaria 2). Por el contrario, el agente inductor de sudor clásico, la pilocarpina, utilizado por la prueba de sudor estándar y los sistemas portátiles previamente informados22,30,36 ofrece solo un período corto de sudor y una tasa de sudoración muy limitada de las glándulas sudoríparas vecinas (Fig. 3f-h). ). Además, tomar muestras de la mezcla del sudor filtrado debajo del gel de pilocarpina y el líquido del gel podría provocar errores sustanciales en los sensores portátiles y no proporcionar información en tiempo real debido a la ausencia de un refrescante refrescante del sudor. Para nuestro módulo de iontoforesis se utiliza una corriente muy pequeña (50–100 µA), en comparación con la corriente de 1–1,5 mA comúnmente utilizada (refs. 22,30,36), lo que reduce en gran medida el riesgo de irritación de la piel. Para maximizar la eficiencia del muestreo de sudor de bajo volumen y mejorar la resolución temporal de la detección portátil, se diseñó cuidadosamente un módulo de microfluidos compacto y flexible para aislar las áreas de muestreo de sudor de los geles de iontoforesis. Se realizaron simulaciones numéricas para optimizar el diseño geométrico del módulo de microfluidos, incluido el número de entrada, el intervalo de ángulo, la orientación y la dirección del flujo con respecto a la geometría del depósito (Fig. 3i, Nota complementaria 3, Figuras complementarias 31 y 32, Video complementario 2). y Tabla complementaria 4). Con el diseño optimizado para la inducción y el muestreo del sudor, el sudor se puede inducir convenientemente localmente y tomar muestras fácilmente con los microfluidos de entrada múltiple durante un período prolongado (Fig. 3g, j, Fig. 33 complementaria y Video complementario 3). A tasas de sudor fisiológico que oscilan entre 0,15 µl min-1 y 3 µl min-1, nuestro parche sensor portátil podría proporcionar un análisis confiable y preciso de los cambios dinámicos de los niveles de AA (Figuras complementarias 34 y 35).

La evaluación del sistema portátil se realizó primero mediante la detección de Trp y Tyr del sudor en sujetos humanos durante una prueba de ejercicio de ciclismo con carga constante (Fig. 4a-d y Fig. complementaria 36). Los datos DPV de los sensores se transmitieron de forma inalámbrica junto con las lecturas del sensor de temperatura y Na+ a la aplicación móvil que extrajo automáticamente los picos de oxidación utilizando un algoritmo de corrección de línea de base iterativo desarrollado a medida (Fig. 4e y Fig. complementaria 37) y realizó la calibración para el Cuantificación precisa del sudor Tyr y Trp. Teniendo en cuenta que los AA (por ejemplo, Try y BCAA) desempeñan un papel crucial en la fatiga central durante el ejercicio físico46, se utilizó una matriz de sensores Trp y BCAA flexibles para monitorear la dinámica de los AA durante el ejercicio vigoroso (Fig. 4f-j y Fig. complementaria 38). ). Tanto los niveles de Trp como los de BCAA disminuyeron durante el ejercicio debido a la síntesis de serotonina y la ingesta de BCAA, respectivamente. Se observó un aumento de la relación Trp/BCAA en el sudor, lo que potencialmente podría servir como un indicador de fatiga central, de acuerdo con un informe anterior sobre su contraparte en plasma46.

a – d, Análisis continuo de Trp y Tyr en el cuerpo utilizando una matriz de sensores portátiles con calibraciones de sensores en tiempo real durante el ejercicio de ciclismo. e, Análisis de voltamograma personalizado con una estrategia automática de extracción de picos basada en un procedimiento de ajuste y corte polinomial. f – j, Análisis dinámico de Trp del sudor y BCAA durante el ejercicio físico para el seguimiento central de la fatiga. Las líneas discontinuas en h – j representan líneas de tendencia de ajuste cuadrático. k – o, análisis dinámico de los niveles de AA en el sudor con y sin ingesta de suplementos Trp y Tyr en reposo para un seguimiento nutricional personalizado.

Datos fuente

El parche portátil integrado con iontoforesis permite la monitorización diaria continua de AA en reposo más allá del ejercicio físico. Como se ilustra en las figuras 4k – o y las figuras complementarias. 39-42, se observaron niveles crecientes de Trp y Tyr en el sudor en los cuatro sujetos después de la ingesta de suplementos de Trp y Tyr, mientras que las lecturas de los sensores permanecieron estables durante los estudios sin ingesta. Esta capacidad abre la puerta a un seguimiento y gestión nutricional personalizados a través de una intervención dietética personalizada guiada por sensores. Cabe señalar que nuestro estudio piloto demostró que los niveles de nutrientes y electrolitos en el sudor eran independientes de los cambios en la tasa de sudoración durante el sudor inducido por iontoforesis basada en carbacol (Figura complementaria 43).

El síndrome metabólico, caracterizado por obesidad abdominal y resistencia a la insulina, está aumentando actualmente como la principal causa de morbilidad y mortalidad y afecta a más de un tercio de todos los adultos en los Estados Unidos47. Los niveles elevados de BCAA circulantes predicen la obesidad resistente a la insulina y el síndrome metabólico, y están relacionados con las ECV y la DM2 (Fig. 5a y Nota complementaria 4) 3,4, lo que podría conducir a posibles complicaciones de la COVID-19 grave (ref. 12 ). Estudios recientes han demostrado el uso potencial de la suplementación con BCAA como intervención dietética para mejorar la resistencia a la insulina48. El seguimiento de los cambios en los niveles de nutrientes esenciales proporciona una detección temprana altamente sensible de los riesgos del síndrome metabólico, lo que permite una intervención dietética personalizada eficaz (Fig. 5b). Para explorar el uso de BCAA en el sudor como factor de riesgo no invasivo del síndrome metabólico, realizamos un estudio piloto para investigar las correlaciones entre los BCAA en suero y en el sudor en tres grupos de sujetos: peso normal (I, n = 10), sobrepeso/ obesidad (II, n = 7) y obesidad con DM2 (III, n = 3) (Fig. 5c, d). Se observaron coeficientes de correlación de Pearson positivos de 0,66 (n = 65) y 0,69 (n = 65) entre los niveles de sudor y suero (todos analizados por los sensores) de Leu y BCAA totales, respectivamente (Fig. 5c). En comparación con los participantes sanos en el grupo I, se observaron niveles sustancialmente elevados de Leu en suero y sudor (analizados por los sensores) en los grupos II y III (Fig. 5d), lo que coincide con informes anteriores de que se identificaron niveles circulantes de BCAA más altos en individuos con obesidad y DM23. Teniendo en cuenta el papel bien establecido de los BCAA en la producción de insulina y la inhibición de la glucogenólisis, también investigamos la respuesta posprandial de los Leu/BCAA en el sudor y la glucosa/insulina en sangre después del suplemento de BCAA y la ingesta dietética en sujetos sanos (Fig. 5e, f). . Todos los biomarcadores permanecieron estables durante el período de ayuno; La ingesta de una dieta proteica provocó aumentos tanto de la glucosa en sangre como de la insulina, mientras que la ingesta de BCAA sólo provocó un rápido aumento de la insulina. En ambos estudios, el sudor Leu y los BCAA aumentaron primero entre los 30 y 60 minutos y luego disminuyeron. Para sujetos con diferentes condiciones metabólicas, los niveles de Leu en el sudor iontoforético después de BCAA varían de manera diferente: aunque se observó un aumento sustancial en los niveles de Leu en el sudor en todos los casos, los sujetos sanos mostraron una fluctuación porcentual drástica y los individuos con obesidad/DM2 mostraron una fluctuación atenuada que puede indicar las diferentes etapas metabólicas de BCAA en esos individuos (Fig. 5g).

a, Niveles elevados de BCAA identificados en individuos con obesidad y/o DM2. b, Las estrechas asociaciones entre el metabolismo de los BCAA y la respuesta a la insulina en grupos sanos y con obesidad/DM2. c, Correlación de los niveles totales de BCAA y Leu en suero y sudor obtenidos con los sensores LEG-MIP (n = 65). Las líneas discontinuas representan líneas de tendencia de ajuste lineal. d, Gráfico de caja y bigotes de los niveles medidos de Leu en sudor y suero extraídos por iontoforesis en tres grupos de participantes: peso normal (grupo I, n = 10), sobrepeso u obesidad (grupo II, n = 7) y obesidad con DM2 (grupo III, n = 3). El bigote inferior representa el mínimo, el bigote superior representa el máximo y el cuadrado del cuadro representa la media. e, f, cambios dinámicos de Leu en sudor y BCAA totales, niveles de insulina sérica (Ins) y glucosa en sangre (BG) de dos sujetos sanos con ingesta de 5 g de BCAA (e) y una dieta estándar de proteínas (f). g, dinámica de Sweat Leu recopilada de los grupos I a III después de la ingesta de 5 g de BCAA. Recuadro, relación entre el nivel de Leu a los 50 minutos después de la ingesta de BCAA y el nivel antes de la ingesta. h, Evaluación de Leu como huella metabólica de la gravedad de COVID-19 en muestras de suero de sujetos con COVID-19 negativo (n = 8) y pacientes con COVID-19 positivo (n = 8). Las barras de error representan la sd de tres mediciones.

Datos fuente

Teniendo en cuenta que se ha informado que la circulación elevada de Leu es una huella metabólica clave para la gravedad de la COVID-19, también evaluamos nuestros biosensores para analizar las muestras de pacientes con COVID-19 e individuos sanos; Se identificaron niveles de Leu sustancialmente elevados en muestras positivas para COVID-19 en comparación con las negativas (415,6 ± 133,7 versus 151,5 ± 36,0 µM), lo que indica el gran potencial de nuestros biosensores para el monitoreo y manejo de COVID-19 en el hogar (Fig. 5h ).

Los biomarcadores metabólicos circulantes, como los AA y las vitaminas, se han asociado con diversas afecciones de salud, incluidas la diabetes y las enfermedades cardiovasculares. El perfil metabólico mediante sensores portátiles se ha vuelto cada vez más crucial en la nutrición y la medicina de precisión, especialmente en la era de la pandemia de COVID-19, ya que proporciona no solo información sobre la gravedad de la enfermedad, sino también orientación para mantenerse metabólicamente saludable y minimizar el riesgo de posible infección por COVID-19. Dado que la pandemia sigue siendo rampante en todo el mundo y los servicios médicos regulares corren el riesgo de escasez, existe una necesidad urgente de desarrollar y aplicar sensores portátiles que puedan monitorear las condiciones de salud a través de perfiles metabólicos para lograr un diagnóstico en el hogar y una intervención oportuna a través de la telemedicina. Sin embargo, los sensores electroquímicos portátiles actuales están limitados a una gama estrecha de objetivos de detección debido a la falta de estrategias de detección continua más allá de los electrodos enzimáticos y selectivos de iones. Aunque se han desarrollado varios sensores basados ​​en bioafinidad para detectar un espectro más amplio de objetivos utilizando anticuerpos o MIP, generalmente requieren múltiples pasos de lavado o se usan una sola vez; estas limitaciones han obstaculizado su utilidad en dispositivos portátiles. Además, la mayoría de los biosensores portátiles dependen del ejercicio vigoroso para acceder al sudor y no son adecuados para el uso diario continuo.

Al integrar LEG producibles en masa, RAR sintetizados electroquímicamente y 'anticuerpos artificiales', hemos demostrado una poderosa estrategia de biodetección universal y portátil que puede lograr la detección selectiva de una amplia gama de biomarcadores (incluidos todos los AA, vitaminas, metabolitos, lípidos, hormonas y medicamentos) y regeneración in situ confiable. Además, para permitir un seguimiento metabólico y nutricional continuo y bajo demanda en todas las actividades, hemos integrado el conjunto de sensores LEG-MIP y la inducción del sudor basada en iontoforesis en una tecnología portátil inalámbrica, con muestreo de sudor del reflejo del axón sudomotor de microfluidos de múltiples entradas optimizado. Procesamiento de señales in situ, calibración y comunicación inalámbrica. Utilizando esta tecnología de telemedicina, hemos demostrado el monitoreo continuo y portátil de las respuestas posprandiales de AA para identificar riesgos de síndrome metabólico. La alta correlación entre el sudor y los BCAA en suero sugiere que esta tecnología es muy prometedora para su uso en el seguimiento del riesgo de síndrome metabólico. La diferencia sustancial en Leu entre las muestras de sangre positivas y negativas para COVID-19 indica el potencial del uso de esta tecnología para el manejo de la COVID-19 en el hogar. Prevemos que esta tecnología portátil podría desempeñar un papel crucial en la realización de una nutrición de precisión mediante el monitoreo continuo de los biomarcadores circulantes y permitiendo una intervención nutricional personalizada. Esta tecnología también podría reconfigurarse para monitorear continuamente una variedad de otros biomarcadores hacia una amplia gama de aplicaciones preventivas, diagnósticas y terapéuticas personalizadas.

El ácido úrico, la l-tirosina, el nitrato de plata, el cloruro de hierro (III), el clorhidrato de dopamina, el cloruro de colina, la creatinina, la sal cálcica del ácido pantoténico, la citrulina, la piridoxina y el ácido láctico se adquirieron de Alfa Aesar. Tiosulfato de sodio pentahidrato, bisulfito de sodio, triptófano, leucina, alanina, isoleucina, metionina, valina, lisina, clorhidrato de tiamina, serina, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, AQCA, ácido 3-aminofenilborónico (APBA), anilina, o-fenilendiamina, azul de metileno , tionina, hidrato de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), etanolamina, N-(3-dimetil-aminopropil)-N′-etilcarbodiimida (EDC), sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS), suero bovino la albúmina (BSA), el clorhidrato de tris (hidroximetil) aminometano (Tris-HCl), el conjugado de estreptavidina-peroxidasa (Roche) y la hidroquinona se adquirieron de Sigma-Aldrich. Las perlas magnéticas modificadas con ácido carboxílico (MB; Dynabeads, M-270) se obtuvieron de Invitrogen. El ferricianuro de potasio y el ferrocianuro de potasio se adquirieron de Acros Organics. Ácido acético, metanol, acetato de sodio, cloruro de sodio, dihidrogenofosfato de sodio, cloruro de potasio, hidrogenofosfato de potasio, urea, ácido l-ascórbico y dextrosa (d-glucosa) anhidra, glicina, arginina, inositol, ornitina, ácido aspártico, treonina, histidina, riboflavina, creatina, fenilalanina, ácido nicotínico, ácido fólico, ácido glutámico y peróxido de hidrógeno (30 % (p/v)) se adquirieron de Thermo Fisher Scientific. El anticuerpo de captura de insulina y el anticuerpo detector biotinilado se adquirieron de sistemas de investigación y desarrollo (Human/Canine/Porcine Insulin DuoSet ELISA). Los electrodos de carbono serigrafiados y el soporte magnético se adquirieron en Metrohm DropSens. Los adhesivos médicos se adquirieron de 3 M y Adhesivos Research. Las películas de PI (75 µm de espesor) se adquirieron de DuPont. Se adquirieron películas de PET (12 µm de espesor) de McMaster-Carr.

Los electrodos LEG se fabricaron sobre una película de PI con un espesor de 75 μm (DuPont) con un cortador láser de CO2 de 50 W (Universal Laser System). Al grabar el PI con un cortador láser de CO2, la energía láser absorbida se convierte en calor local y, por lo tanto, conduce a una temperatura localizada elevada (>2.500 °C), se rompen los enlaces químicos en la red PI y se produce una reorganización térmica del carbono. átomos se produce, lo que da como resultado láminas de estructuras de grafeno. Los parámetros optimizados para los electrodos de grafeno y las conexiones electrónicas fueron potencia del 8%, velocidad del 15% y puntos por pulgada (PPI) de 1000 en modo ráster con escaneo triple. Para el área de detección activa del sensor de temperatura, los parámetros optimizados fueron potencia del 3 %, velocidad del 18 % y PPI 1000 en modo vectorial con escaneo único. Para preparar el electrodo de referencia, primero se modificó Ag en el electrodo de grafeno correspondiente mediante electrodeposición multicorriente con una estación de trabajo electroquímica (CHI 832D) a −0,01 mA durante 150 s, −0,02 mA durante 50 s, −0,05 mA durante 50 s, − 0,08 mA durante 50 s y −0,1 mA durante 350 s utilizando una solución de revestimiento que contiene nitrato de plata 0,25 M, tiosulfato de sodio 0,75 M y bisulfito de sodio 0,5 M. Para obtener el electrodo de Ag/AgCl, se dejó caer una solución de FeCl3 0,1 M sobre la superficie de Ag durante 30 s, y luego se prepararon 3 µl de cóctel de referencia de polivinilbutiral (PVB) disolviendo 79,1 mg de PVB y 50 mg de NaCl en 1 ml de Se dejó caer metanol sobre el electrodo de Ag/AgCl y se secó durante la noche. El electrodo selectivo de Na+ se preparó de la siguiente manera: 0,6 µl de cóctel de membranas selectivas de Na+ preparado disolviendo 1 mg de ionóforo X de Na, 0,55 mg de tetrakis[3,5-bis(trifluorometil)fenil]borato de sodio, 33 mg de cloruro de polivinilo y Se vertieron 65,45 mg de sebacato de bis(2-etilhexilo) en 660 µl de tetrahidrofurano sobre el electrodo de grafeno y se secaron durante la noche. Para obtener el rendimiento de detección de Na+ estable deseado para mediciones continuas a largo plazo, el sensor de Na+ obtenido se acondicionó durante la noche en NaCl 100 mM.

El proceso de fabricación de la matriz de sensores LEG-MIP se ilustra en la figura complementaria 6. Todas las capas MIP se sintetizan mediante electropolimerización. La solución de polimerización se preparó disolviendo un molde 5 mM (por ejemplo, AA objetivo), APBA 12,5 mM y pirrol 37,5 mM en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,01 M (pH 6,5). Para el sensor BCAA multi-MIP, se utilizaron 5 mM de cada objetivo (es decir, Leu, Ile y Val). Antes de la deposición de MIP, la LEG se activó en H2SO4 0,5 M con exploraciones CV para 60 segmentos (-1,2 a 1 V con una velocidad de exploración de 500 mV s-1). Para los sensores LEG-MIP de detección directa, el polímero impreso objetivo se sintetizó electroquímicamente en el electrodo LEG con deposición CV (0–1 V durante diez ciclos, 50 mV s-1) utilizando la solución de polimerización preparada. Las moléculas diana se extrajeron sumergiendo el electrodo en una mezcla de ácido acético/metanol (7:3 v/v) durante 1 h. Posteriormente, el electrodo resultante se sumergió en PBS 0,01 M (pH 6,5) para exploraciones CV repetitivas (0,4–1 V con una velocidad de exploración de 50 mV s-1) hasta que se obtuvo una respuesta estable. Para el polímero no impreso LEG, el electrodo se preparó siguiendo el mismo procedimiento que LEG-MIP, excepto que no se agregó ninguna plantilla a la solución de polimerización.

Para los sensores MIP de detección indirecta, primero se modificaron RAR sintetizados electroquímicamente (por ejemplo, PBNP o AQCA) en el electrodo LEG. El PBNP RAR en la LEG se preparó con CV (20 ciclos) (-0,2 a 0,6 V con una velocidad de escaneo de 50 mV s-1) en una solución acuosa que contenía FeCl3 3 mM, K3Fe(CN)6 3 mM, 0,1 M. HCl y KCl 0,1 M. Es necesaria una capa de PBNP con una señal redox adecuada para producir una buena sensibilidad para los sensores MIP finales; Para lograr esta señal redox estable y adecuada, el electrodo LEG se enjuagó con agua destilada después de la deposición inicial de azul de Prusia (PB), y el paso de electrodeposición de PB se repitió dos veces más hasta que se obtuvo un pico estable de LSV de 70 µA en solución de KCl 0,1 M. logrado. Posteriormente, se enjuagó el LEG-PB con agua destilada y se sumergió en una solución que contenía HCl 0,1 M y KCl 0,1 M para exploraciones CV repetitivas (-0,2 a 0,6 V con una velocidad de exploración de 50 mV s-1) hasta que se obtuvo una respuesta estable. obtenido. Para preparar el AQCA RAR en la LEG, primero se incubó el electrodo LEG en 50 µl de PBS (pH 6,5) con AQCA 5 mM a 4 °C durante la noche. Posteriormente, se enjuagó el LEG-AQCA con agua destilada y se sumergió en una solución tampón de fosfato para exploraciones CV repetitivas (-0,8 a 0 V con una velocidad de exploración de 50 mV s-1) hasta que se obtuvo una respuesta estable. Para los sensores LEG-PB-MIP de detección indirecta, se realizó un proceso de activación de PB adicional justo después de la extracción de la plantilla (escaneo IT a 1 V en HCl 0,5 M durante 600 s), seguido de un proceso de estabilización del sensor LEG-PB-MIP. en KCl 0,1 M (exploraciones CV de −0,2 a 0,6 V con una velocidad de exploración de 50 mV s−1). Cabe señalar que, para el sensor LEG–AQCA–MIP, solo se utilizaron tres ciclos de polimerización CV para preparar la capa MIP, y el sensor se estabilizó en PBS 0,01 M (pH 6,5) (escaneos CV de −0,8 a 0 V con una velocidad de exploración de 50 mV s-1).

La morfología de los materiales se caracterizó mediante microscopía electrónica de barrido (Nova Nano SEM 450) y microscopía electrónica de transmisión (Talos S-FEG FEI, EE. UU.). El espectro Raman de los electrodos con diferente modificación se registró utilizando un láser de 532,8 nm con un inVia Reflex (Renishaw). Los espectros infrarrojos por transformada de Fourier se midieron mediante espectrometría infrarroja (Nicolet 6700).

Se caracterizó un conjunto de sensores electroquímicos en soluciones de analitos objetivo. Todas las caracterizaciones de sensores in vitro se realizaron a través de CHI 832D. La respuesta del sensor de Na+ se caracterizó con mediciones de potencial de circuito abierto en las soluciones que contenían niveles variados de Na+. El análisis DPV se realizó para todas las caracterizaciones del sensor LEG-MIP de detección directa en PBS 0,01 M (pH 6,5) o en sudor crudo. Las condiciones de DPV fueron las siguientes: rango, 0,4–1 V; potencial incremental, 0,01 V; amplitud de pulso, 0,05 V; ancho de pulso, 0,05 s; período de pulso, 0,5 s; y sensibilidad, 1 × 10−5 AV−1. Para la detección indirecta in vitro de las moléculas diana basadas en los sensores LEG-PB-MIP, se realizó un análisis de LSV (0,4-0 V) en KCl 0,1 M. Las condiciones de LSV fueron las siguientes: rango, 0,4–0 V; velocidad de exploración, 0,005 V s-1; intervalo de muestra, 0,001 V; tiempo de silencio, 2 s; y sensibilidad, 1 × 10−4 AV−1. Para la detección indirecta in vitro de las moléculas diana basadas en los sensores LEG – AQCA – MIP, se realizó un análisis de DPV negativo (0 a −0,8 V) en PBS 0,01 M. Las condiciones negativas de DPV fueron las siguientes: 0 a −0,8 V; potencial incremental, 0,01 V; amplitud de pulso, 0,05 V; ancho de pulso, 0,05 s; período de pulso, 0,5 s; y sensibilidad, 1 × 10−5 AV−1. Para la medición in situ del analito del sudor, se registraron curvas de fondo y de señal antes y después de la incubación; la corriente de la señal se obtuvo como la diferencia de las amplitudes máximas entre la señal posterior a la incubación y las curvas de corriente de fondo (Fig. 3b-d y Fig. complementaria 29). La caracterización del sensor de temperatura se llevó a cabo en una placa calefactora de cerámica (Thermo Fisher Scientific) (Figura complementaria 28). La respuesta del sensor se registró utilizando un analizador de parámetros (Keithley 4200A-SCS) y se comparó con las lecturas de un termómetro infrarrojo (LASERGRIP 800; Etekcity).

Para evaluar el rendimiento de los diversos sustratos de electrodos para la detección AA basada en MIP, se eligieron LEG, electrodo de carbón impreso, electrodo de Au y electrodo de carbón vítreo. Los electrodos de carbón vítreo se adquirieron en CH Instruments. Los electrodos de carbono impresos se imprimieron sobre el sustrato PI utilizando una impresora Dimatix Materials DMP-2850 (Fujifilm, Minato, Japón) con una tinta de carbono comercial de NovaCentrix. Los electrodos de Au se fabricaron mediante evaporación con haz de E: se depositaron 20 nm de Cr y 100 nm de Au sobre un sustrato de PET pretratado con plasma de O2. Las películas MIP se prepararon con deposición CV (0–1 V durante diez ciclos, 50 mV s−1).

El módulo de microfluidos se fabricó utilizando un cortador láser de CO2 de 50 W (Sistema Láser Universal) (Figura 1 complementaria). Brevemente, se modelaron capas de adhesivos médicos de una y dos caras (3M) con canales, entradas, contornos del gel de iontoforesis y depósitos. Para todas las capas de microfluidos, los contornos del gel de iontoforesis se modelaron para permitir el flujo de corriente desde la capa superior del electrodo PI. La capa inferior, que es la capa adhesiva de doble cara en contacto con la piel (capa de acumulación), se modeló con un pozo de acumulación de sudor (3M 468MP, parámetros del láser: potencia 60%, velocidad 90%, PPI 1000). La segunda capa (la capa de entrada), en contacto con la capa de acumulación, se modeló con las entradas múltiples (PET de 12 μm de espesor, parámetros del láser: potencia 20 %, velocidad 100 %, PPI 1000). La tercera capa (capa de canal), en contacto con la capa de entrada, se modeló con canales de microfluidos (Adhesives Research 93049, parámetros del láser: potencia 45%, velocidad 100%, PPI 1000). La cuarta capa (capa de depósito), intercalada entre la capa de canal y la capa de PI del electrodo, se modeló con el depósito y la salida (3M 468MP, parámetros del láser: potencia 60%, velocidad 90%, PPI 1000). El depósito es una elipse con un eje mayor de 5,442 mm y un eje menor de 4,253 mm para encerrar completamente el área de detección activa. El espesor de la capa del canal es de ~0,1 mm (Adhesives Research 93049) y el espesor de la capa del depósito es de 0,13 mm (3M 468MP). El área del depósito es de 18,17 mm2 y, por lo tanto, el volumen del depósito se puede calcular como el área multiplicada por el espesor de la capa del depósito (0,13 mm), que totaliza 2,36 µl.

Se prepararon hidrogeles que contenían el agente muscarínico carbacol como sigue. Brevemente, para el gel anódico, se añadió agarosa (3% p/p) a agua desionizada y luego se calentó a 250 °C con agitación constante. Después de que la mezcla hirvió completamente y se volvió homogénea sin granos de agarosa, la mezcla se enfrió hasta 165 °C y se añadió carbacol al 1 % a la mezcla anterior. Posteriormente, la mezcla enfriada se vertió lentamente en moldes cilíndricos prefabricados o en un parche de microfluidos ensamblado y se solidificó durante 10 minutos a 4 °C. El gel catódico se preparó de manera similar excepto que se usó NaCl (1% p/p) en lugar de carbacol.

El diagrama de bloques del sistema electrónico (Fig. 1g y Fig. 4 complementaria) representa tanto el parche electrónico portátil como el reloj inteligente que puede (1) inducir el sudor mediante iontoforesis y (2) controlar el sudor mediante métodos electroquímicos. Los procedimientos de inducción y detección de sudor son iniciados y controlados por el microcontrolador (STM32L432KC, STMicroelectronics) cuando recibe un comando del usuario desde el módulo Bluetooth a través de la comunicación receptor-transmisor asíncrono universal (UART).

La corriente iontoforética programable se genera mediante una fuente de corriente controlada por voltaje que consta de un amplificador diferencial de ganancia unitaria (AD8276, Analog Devices) y un transistor elevador (BC846, ON Semiconductor). El circuito se alimenta mediante la salida de un convertidor elevador (LMR64010) que aumenta el voltaje de la batería de 3,7 V a 36 V. El microcontrolador controla el convertidor digital a analógico (DAC) (DAC8552, Texas Instruments) a través de una interfaz periférica en serie para Establece el voltaje de control de la fuente de corriente. La salida de la fuente actual es verificada por un comparador (TS391, STMicroelectronics) y el microcontrolador se interrumpe a través de su pin de entrada/salida de uso general en caso de falla de salida. El circuito de protección consta de un limitador de corriente (MMBF5457, ON Semiconductor) e interruptores analógicos (MAX4715, Maxim Integrated; ADG5401, Analog Devices). La entrada/salida de propósito general del microcontrolador también se utiliza para habilitar o deshabilitar el circuito de iontoforesis. Para el diseño optimizado, se aplicó una corriente de 100 µA (~2,6 µA mm-2) para la inducción del sudor por iontoforesis corporal utilizando el parche de microfluidos flexible.

Cuando se alimenta a 3,3 V, el sistema electrónico consume ~28 mA durante una medición electroquímica activa y ~61 mA durante la iontoforesis. El microcontrolador y el módulo Bluetooth consumen cada uno ~12 mA; la interfaz del sensor consume ~4 mA; el convertidor elevador y el módulo de iontoforesis consumen ~33 mA; y el módulo de visualización consume ~8 mA adicionales al actualizar su pantalla.

El circuito de detección de sudor puede realizar DPV simultánea de dos canales, así como mediciones potenciométricas y de temperatura. Un circuito bipotenciostato está construido por un amplificador de control (AD8605) y dos amplificadores de transimpedancia (AD8606). Se utiliza una referencia de voltaje en serie (ISL60002, Renesas Electronics) y un DAC (DAC8552, Texas Instruments) para generar una polarización de potencial dinámico entre los electrodos de referencia y de trabajo. Se utiliza un amplificador de instrumentación (INA333, Texas Instruments) para mediciones potenciométricas y un divisor de voltaje para el sensor de temperatura resistivo. Todas las señales de voltaje analógico son adquiridas por los canales del convertidor analógico a digital (ADC) integrados del microcontrolador, procesadas y luego transmitidas a través de Bluetooth a un dispositivo de usuario.

La aplicación móvil personalizada se desarrolló con el marco multiplataforma Flutter. La aplicación móvil puede comunicarse de forma inalámbrica con los dispositivos portátiles a través de Bluetooth para enviar comandos y adquirir, procesar y visualizar los niveles de biomarcadores del sudor. La aplicación establece una conexión Bluetooth segura con el sensor portátil. La página de inicio traza los niveles históricos de biomarcadores del usuario y resalta las concentraciones de analitos medidas más recientemente. Cuando se solicita una medición de biomarcadores de sudor, el usuario puede cambiar a la página de medición que traza los voltamogramas de los sensores de sudor en tiempo real. Después de la medición voltamperométrica, la aplicación extrae las corrientes máximas de los voltamogramas utilizando un algoritmo de corrección de referencia personalizado y luego convierte las corrientes máximas en las concentraciones de biomarcadores correspondientes. Estos datos de medición se agregan a la lista de niveles históricos de analitos en la página de inicio.

Los análisis del tiempo de actualización se realizaron mediante simulaciones numéricas (COMSOL). Se crearon modelos tridimensionales de diferentes diseños de microfluidos con las mismas dimensiones del dispositivo real en Rhinoceros y se importaron a COMSOL Multiphysics. El proceso de transporte de masa se simuló resolviendo numéricamente la ecuación de Stokes para un flujo incompresible junto con la ecuación de convección-difusión (Nota complementaria 3).

La validación y evaluación del sensor de sudor se realizó con sujetos humanos de conformidad con todas las regulaciones éticas según los protocolos (ID 19-0892 y 21-1079) que fueron aprobados por la junta de revisión institucional del Instituto de Tecnología de California. Los sujetos participantes (mayores de 18 años) fueron reclutados en el campus del Instituto de Tecnología de California y en las comunidades vecinas a través de publicidad. Todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito antes de participar en el estudio. Para la evaluación del sensor portátil, se reclutaron sujetos sanos con un índice de masa corporal (IMC) de 18,5 a 24,9 kg m-2 con glucosa sérica en ayunas <100 mg dl-1. Para el estudio BCAA, los criterios de inclusión incluyen: grupo I, individuos con peso normal que tienen un IMC de 18,5 a 24,9 kg m-2 con glucosa sérica en ayunas <100 mg dl-1 (sanos); grupo II, individuos con sobrepeso/obesidad que tienen un IMC de 25 a 35 kg m-2 y glucosa sérica en ayunas <6 mg dl-1 (sobrepeso/obesidad); grupo III, individuos con obesidad que tienen un IMC de 25 a 35 kg m-2 y glucosa sérica en ayunas ≥126 mg dl-1 (obesidad y DM2). Se compraron muestras de suero positivas y negativas para COVID-19 de RayBiotech.

El análisis por GC-MS de los AA en muestras de sudor y suero se realizó utilizando el kit EZ:Faast de Phenomenex, que permite la preparación de muestras, la derivatización y el análisis por GC-MS de AA libres. Se utilizó un Varian Saturn 2000 para las pruebas de GC-MS. Se inyectó un microlitro de solución de muestra preparada para GC en gas portador de helio a un flujo constante de 1,0 ml min-1 con una presión de pulso de 20 libras por pulgada cuadrada durante 0,2 min, con el horno programado de 110 °C a 320 °C a 32 °C mín-1. La cromatografía de masas se configuró con la fuente a 240 °C, la cuádruple a 180 °C y la auxiliar a 310 °C con un rango de escaneo de 45 a 450 m/z a una velocidad de muestreo de 3,5 escaneos s-1. Se utilizó el monitoreo de iones seleccionados, que registra la corriente de iones en masas seleccionadas que son características de ciertos AA en un tiempo de retención esperado49. Por ejemplo, después de la derivatización del kit EZ:Faast, Trp tiene una masa característica en 130 con un tiempo de retención de alrededor de 5,1 min, y la altura del pico se registra para las mediciones de Trp en el número de ion 130 y a 5,1 min del espectro de datos sin procesar. . El estándar interno (IS; norvalina) se agregó durante el proceso de derivatización de la muestra para tener en cuenta el posible aumento inducido por la evaporación en la detección de picos; la altura del pico de IS norvalina se registra en su número de ion 158 a los 1,65 min (Figura complementaria 26). La altura del pico Trp registrada a partir del espectro de datos sin procesar se calibró con respecto al IS en la misma ejecución: altura del pico Trp normalizada = altura del pico Trp/altura del pico IS. Con alturas de pico normalizadas de diferentes niveles de estándares Trp, se construyeron gráficas de calibración. Para otras muestras, se utilizó la altura del pico normalizado de Trp para calcular la concentración.

Para validar el sistema de sensor portátil, realizamos ejercicios de ciclismo con carga constante en sujetos sanos. Los sujetos se presentaron al laboratorio después de ayunar durante la noche y se les dio una bebida proteica estandarizada (Fairlife, Core Power Elite). Se limpiaron la frente y el cuello de los sujetos con hisopos con alcohol y gasa antes de colocar los parches sensores en el cuerpo. Para las pruebas de ciclismo se utilizó una bicicleta estática (Kettler Axos Cycle M-LA). Los sujetos pedalearon a 60 rpm durante 60 min o hasta la fatiga. Durante la prueba en el cuerpo, los datos de los parches del sensor se enviaron de forma inalámbrica a la interfaz de usuario a través de Bluetooth. Cuando los sujetos comenzaron a andar en bicicleta, el sistema de sensores adquirió y transmitió continuamente datos de sensores de temperatura y sodio. Cada minuto, el sistema electrónico iniciaba una polarización de voltaje transitorio entre los electrodos de referencia y de trabajo. Cuando el sesgo activaba una corriente por encima de un umbral determinado experimentalmente, el sistema iniciaba un ciclo de limpieza de CV y ​​luego el primer escaneo de DPV como fondo inicial sin incubación del objetivo. La exploración DPV se repitió 7 minutos después como la curva postincubación. Entre las dos exploraciones, se registraron continuamente los datos de los sensores de temperatura y sodio. Inmediatamente después de la DPV posterior a la incubación, comenzó otro ciclo con un paso de limpieza/regeneración de TI, seguido de un escaneo inicial de DPV en segundo plano. Los datos recopilados de temperatura, sodio y DPV se transmitieron de forma inalámbrica a un dispositivo de usuario a través de Bluetooth en tiempo real, donde los datos moleculares se extrajeron, calibraron y convirtieron a niveles de concentración. Se recogieron periódicamente muestras de sudor de los sujetos durante los estudios utilizando tubos de centrífuga. Luego, las muestras de sudor se congelaron a -20 °C para realizar más pruebas y validación mediante pruebas electroquímicas con biosensores y análisis GC-MS.

Los sujetos acudieron al laboratorio después de ayunar durante la noche. Los brazos de los sujetos se limpiaron con hisopos con alcohol y gasa antes de colocar los parches sensores en el cuerpo. Los sujetos recibieron suplementos Tyr y Trp (1 g cada uno) para el estudio de ingesta. Por el contrario, el estudio de control se realizó en sujetos sin ingesta suplementaria. Se aplicó iontoforesis de cinco minutos a los sujetos. El proceso de registro de datos del sensor fue el mismo que en las pruebas en humanos basadas en ejercicios.

Para los estudios de BCAA, se pidió a los sujetos que consumieran 5 g de BCAA (2:1:1 Leu:Ile:Val) o un refrigerio estandarizado que incluía una bebida proteica (Fairlife, Core Power Elite) y una barra energética CLIF. Se implementó una sesión de iontoforesis con geles de carbacol para la inducción del sudor. Durante todo el período del estudio, se tomaron muestras periódicamente del sudor del sujeto y se analizó mediante el parche sensor. El nivel de glucosa en sangre se registró cada 15 minutos con un medidor de glucosa en sangre Care Touch comercial. Se recogieron muestras de sangre capilar fresca mediante un método de punción en el dedo durante los estudios en humanos. Después de limpiar la yema del dedo con una toallita con alcohol y dejar que se seque al aire, se perforó la piel con un dispositivo de punción CareTouch. Las muestras se recogieron con tubos de centrífuga después de limpiar la primera gota de sangre con una gasa. Una vez finalizado el procedimiento de coagulación estandarizado de 90 minutos, el suero se separó mediante centrifugación a 6000 rpm durante 15 minutos y se almacenó instantáneamente a -20 °C para su análisis con GC-MS, los sensores LEG-MIP y el ensayo de insulina personalizado.

Para el estudio de provocación con la dieta BCAA, las muestras de suero recolectadas se analizaron mediante un inmunoensayo sándwich de insulina personalizado. Los MB fueron modificados sobre la base de una publicación anterior50. Brevemente, se activaron 3 μl de MB con 50 mg ml-1 de EDC/sulfo-NHS en tampón MES (25 mM, pH 5) durante 35 minutos, seguido de la inmovilización del anticuerpo de captura (25 μg ml-1 en tampón MES) durante 15 minutos. Después de la desactivación con etanolamina 1 M en tampón fosfato (0,1 M, pH 8), los MB se incubaron en 25 µl de estándares preparados en BSA al 1% o muestras de suero diluidas cinco veces en BSA al 1% durante 15 minutos. A partir de aquí, las perlas se enjuagaron con BSA al 1% dos veces después de cada paso de unión. A continuación, los MB se incubaron en 25 μl de anticuerpo detector de biotina (1,0 μg ml-1) en BSA al 1% durante 30 minutos, seguido de 15 minutos en conjugado de estreptavidina-peroxidasa (2500 ×) preparado en BSA al 1%. La detección amperométrica se llevó a cabo aplicando un potencial constante de −0,2 V a MB resuspendidos en 45 μl de hidroquinona 1 mM, y se pipetearon 5 μl de H2O2 5 mM sobre los electrodos de carbono serigrafiados cuando se estabilizó la corriente de fondo.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Los datos principales que respaldan los resultados de este estudio están disponibles en el artículo y en su información complementaria. Los datos de origen de las Figs. 4 y 5 y para las Figs complementarias. 36 y 39–41 se proporcionan con este documento. Todos los conjuntos de datos sin procesar y analizados generados durante el estudio están disponibles a pedido del autor correspondiente. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Este proyecto fue apoyado por la subvención R01HL155815 de los Institutos Nacionales de Salud, las subvenciones N00014-21-1-2483 y N00014-21-1-2845 de la Oficina de Investigación Naval, el Instituto de Investigación Traslacional para la Salud Espacial a través de la NASA NNX16AO69A, el Acuerdo Cooperativo de la NASA 80NSSC20M0167, Premio de Investigación Piloto de Alto Impacto T31IP1666 y subvención R01RG3746 del Programa de Investigación de Enfermedades Relacionadas con el Tabaco, Subvención Piloto de la Iniciativa Biomédica Caltech-City of Hope y el Programa de Iniciativa de Innovación Rothenberg del Instituto de Tecnología de California. JT recibió el apoyo de la Beca Nacional de Ciencias (NSS) de la Agencia de Investigación, Tecnología y Ciencia (A*STAR) de Singapur. Agradecemos el apoyo y la infraestructura críticos proporcionados para este trabajo por el Instituto Kavli de Nanociencia de Caltech. Este proyecto se benefició del uso de instrumentación proporcionada por el Centro de Análisis Ambiental de Caltech, y agradecemos el apoyo en GC-MS de N. Dalleska. También agradecemos a Z. Wang por la contribución al desarrollo de aplicaciones móviles, a RM Torrente-Rodríguez por la optimización del ensayo de insulina y a S. Bao por los valiosos aportes.

Estos autores contribuyeron igualmente: Minqiang Wang, Yiran Yang, Jihong Min.

Andrew y Peggy Cherng Departamento de Ingeniería Médica, División de Ingeniería y Ciencias Aplicadas, Instituto de Tecnología de California, Pasadena, CA, EE. UU.

Minqiang Wang, Yiran Yang, Jihong Min, Yu Song, Jiaobing Tu, Cui Ye, Changhao Xu y Wei Gao

Departamento de Física Aplicada y Ciencia de Materiales, División de Ingeniería y Ciencias Aplicadas, Instituto de Tecnología de California, Pasadena, CA, EE. UU.

Daniel Mukasa

Departamento de Ingeniería Eléctrica, División de Ingeniería y Ciencias Aplicadas, Instituto de Tecnología de California, Pasadena, CA, EE. UU.

Nicole Heflin

Departamento de Ciencias Traslacionales de Neoplasias Hematológicas, Instituto de Investigación Beckman en City of Hope, Duarte, CA, EE. UU.

Jeannine McCune

División de Cardiología, Facultad de Medicina David Geffen, Universidad de California, Los Ángeles, CA, EE. UU.

Tzung K. Hsiai

División de Nutrición Clínica, Facultad de Medicina David Geffen, Universidad de California, Los Ángeles, CA, EE. UU.

Zhao Ping Li

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WG, MW, YY y JM iniciaron el concepto y diseñaron los estudios; WG supervisó el trabajo; MW, YY y JM dirigieron los experimentos y recopilaron los datos generales; YS, JT, DM, CY y CX contribuyeron a la caracterización, validación y análisis de muestras del sensor; NH contribuyó al procesamiento de señales y al desarrollo de aplicaciones. JSM, TKH y ZL contribuyeron al diseño de los estudios en humanos. WG, MW, YY y JM coescribieron el artículo. Todos los autores contribuyeron al análisis de los datos y proporcionaron comentarios sobre el manuscrito.

Correspondencia a Wei Gao.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Biomedical Engineering agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Notas complementarias, figuras, tablas y referencias.

Demostración en el cuerpo con la aplicación y el parche sensor diseñados.

Simulación y validación del refrescante del sudor con microfluidos.

Muestreo de sudor de microfluidos inducido por iontoforesis en reposo.

Los datos de origen de las Figs. 4 y 5 y Figs complementarias. 36 y 39–41.

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Reimpresiones y permisos

Wang, M., Yang, Y., Min, J. et al. Un biosensor electroquímico portátil para el seguimiento de metabolitos y nutrientes. Nat. Biomédica. 6 de Inglaterra, 1225–1235 (2022). https://doi.org/10.1038/s41551-022-00916-z

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Recibido: 07 de junio de 2021

Aceptado: 19 de junio de 2022

Publicado: 15 de agosto de 2022

Fecha de emisión: noviembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-022-00916-z

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