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Sep 27, 2023

Modelado computacional combinado y estudio experimental de los mecanismos biomecánicos de las plaquetas.

Communications Biology volumen 6, Número de artículo: 869 (2023) Cite este artículo 315 Accesos 2 Detalles de Altmetric Metrics Si bien la formación de coágulos sanguíneos se ha estudiado relativamente bien, se sabe poco

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 869 (2023) Citar este artículo

315 Accesos

2 altmétrico

Detalles de métricas

Si bien la formación de coágulos sanguíneos ha sido relativamente bien estudiada, se sabe poco sobre los mecanismos subyacentes a la posterior remodelación estructural y mecánica del coágulo llamada contracción o retracción. El deterioro del proceso de contracción del coágulo se asocia tanto con hemorragias potencialmente mortales como con afecciones trombóticas, como accidente cerebrovascular isquémico, tromboembolismo venoso y otros. Recientemente, se observó que la contracción de los coágulos sanguíneos se ve obstaculizada en pacientes con COVID-19. Se desarrolla y utiliza un modelo computacional tridimensional multiescala para cuantificar los mecanismos biomecánicos de la cinética de la contracción del coágulo impulsada por las interacciones de tracción plaquetas-fibrina. Estos resultados proporcionan importantes conocimientos biológicos sobre la contracción de los filopodios plaquetarios, las delgadas protuberancias mecánicamente activas de la membrana plasmática, descritas anteriormente como que realizan principalmente una función sensorial. Los mecanismos biomecánicos y el enfoque de modelado descritos pueden aplicarse potencialmente al estudio de otros sistemas en los que las células están incrustadas en una red filamentosa y ejercen fuerzas sobre la matriz extracelular moduladas por la rigidez del sustrato.

Los coágulos de sangre son estructuras similares a gel que se forman en los sitios de lesiones de los vasos para detener el sangrado. Los coágulos se forman como resultado de reacciones celulares y enzimáticas combinadas que involucran plaquetas y componentes plasmáticos, incluido el fibrinógeno y otros factores de coagulación. Los componentes principales de un coágulo sanguíneo incluyen una red polimérica de fibrina tridimensional con plaquetas unidas a fibras de fibrina y glóbulos rojos incrustados en la red porosa. Después de su formación, los coágulos sanguíneos sufren una contracción volumétrica a través de un proceso llamado contracción o retracción del coágulo, impulsado por plaquetas activadas1 (consulte la Fig. 1, que muestra la agrupación local de plaquetas y un campo de desplazamiento de plaquetas tridimensional de un coágulo en contracción).

a Imagen confocal en serie que muestra la formación de grupos de plaquetas secundarios debido a la aproximación de fibras de fibrina portadoras de plaquetas durante la contracción del coágulo. Las plaquetas son verdes y la fibrina es roja. Barra de escala: 5 μm. b, c Imágenes representativas de un campo de desplazamiento de plaquetas tridimensional de un coágulo en contracción; b vista superior, se muestran los vectores de desplazamiento de fibrina (rojo), plaquetas (verde) y plaquetas; En una vista en perspectiva c, se visualizan las plaquetas (verdes) con sus vectores de desplazamiento (la figura está reimpresa de Kim et al. 16 bajo las condiciones de la licencia Creative Commons CC BY).

La contracción intravital de coágulos sanguíneos o trombos tiene varias implicaciones fisiopatológicas importantes, como que mejora las propiedades de sellado de los coágulos hemostáticos2, reduce el tamaño de los coágulos y mejora el flujo sanguíneo a través de trombos que de otro modo serían obstructivos3, previene la ruptura del coágulo o la embolización trombótica4 y altera la susceptibilidad de los coágulos sanguíneos. a la lisis enzimática5. En consecuencia, el deterioro del proceso de contracción del coágulo se asocia con afecciones trombóticas potencialmente mortales, como el accidente cerebrovascular isquémico3, el tromboembolismo venoso4,6 y otros7. Recientemente, se observó que la contracción de los coágulos sanguíneos se ve obstaculizada en pacientes con COVID-19, especialmente en casos graves y mortales8.

A pesar de su importancia clínica, los mecanismos biomecánicos de la contracción del coágulo no se conocen bien. Se sabe que la contracción de los coágulos sanguíneos es impulsada por fuerzas de tracción generadas por el citoesqueleto de plaquetas que se transmiten a las fibras de fibrina a través de protuberancias de la membrana plasmática altamente adhesivas llamadas filopodios9. Uno de los aspectos menos estudiados de la contracción del coágulo es la formación de filopodios plaquetarios y su interacción física con la red de fibrina. La biomecánica de la contracción del coágulo sanguíneo inducida por plaquetas es fundamental para comprender una multitud de otros procesos biológicos algo similares relacionados con la mecanotransducción celular bidireccional, incluida la motilidad celular, la regeneración y diferenciación de tejidos10,11,12,13,14, la fagocitosis9 y el desarrollo del cáncer15. La mecanobiología estructural cuantitativa de la contracción de coágulos sanguíneos impulsada por plaquetas ha surgido recientemente como una nueva vía de la biomecánica16 y puede proporcionar una base para comprender la interacción biomecánica dinámica y compleja entre las células no musculares y las matrices extracelulares fibrosas de diversas composiciones.

Los mecanismos biomecánicos celulares básicos del proceso de contracción no se dilucidaron hasta nuestro artículo de 201716. En particular, no conocemos ningún artículo que haya investigado el papel de la extensión y retracción de los filopodios plaquetarios en la contracción del coágulo hasta que describimos por primera vez este mecanismo16. A diferencia de otros procesos fisiológicos mediados por células9, el mecanismo que impulsa la contracción del coágulo no ha sido bien conocido ni comúnmente aceptado: ni los artículos más relevantes sobre biomecánica plaquetaria17,18,19,20,21,22 ni uno de los últimos y más completos Los artículos de revisión sobre la contracción del coágulo23 analizan el papel de los filopodios plaquetarios en la contracción del coágulo. Por lo tanto, el papel de la extensión y contracción de los filopodios plaquetarios como fuerza impulsora de la densificación de la red de fibrina no está del todo claro y merece una mayor investigación, incluido el enfoque de modelado que nos permite obtener información mecanicista y cuantitativa sobre la dinámica de los filopodios que no está disponible experimentalmente.

En este artículo, se utiliza una combinación de simulaciones de modelos computacionales en 3D y observaciones experimentales para proporcionar importantes conocimientos mecanicistas sobre los diferentes procesos implicados en la contracción de los coágulos sanguíneos. Los resultados de la simulación del modelo cuantifican los mecanismos a microescala de las interacciones plaquetas-fibrina implicadas en la agrupación de plaquetas y la contracción del coágulo a macroescala. Si bien el modelo permite la interacción entre plaquetas, éstas aparecen sólo una vez que la red se ha compactado lo suficiente y las plaquetas adheridas a fibrina se mueven pasivamente unas cerca de otras. Cuando esto sucede, las plaquetas comienzan a adherirse entre sí y formar grupos secundarios. Las interacciones activas de extracción plaquetas-plaquetas seguidas de su empaquetamiento compacto pueden ser esenciales durante la contracción de los tapones plaquetarios hemostáticos libres de fibrina formados en algunos modelos experimentales de lesión de la pared de un vaso intravital24,25,26. La contracción de dichos agregados plaquetarios libres de fibrina está fuera del alcance de este trabajo, aunque los elementos de nuestro modelo son potencialmente aplicables a la reorganización mecánica y estructural de los agregados plaquetarios en ausencia de fibrina.

Muchos rasgos característicos de los coágulos sanguíneos y sus propiedades dinámicas no pueden medirse experimentalmente en este momento. Por ejemplo, la activación plaquetaria puede implicar la formación de filopodios en cada plaqueta, la unión de filopodios individuales a fibras de fibrina, la generación de fuerzas de tracción y la retracción de filopodios, el acortamiento de fibras de fibrina y la densificación de la red, etc. Segregación y cuantificación de cada una de Estos pasos elementales del proceso de contracción del coágulo son difícilmente factibles, pero estas características pueden estudiarse de forma independiente, así como en conjunto, utilizando un enfoque computacional multiescala. El modelado computacional ofrece la posibilidad de analizar cuantitativamente cada componente estructural y mecánico de un coágulo sanguíneo e integrar el impacto resultante en la contracción de un coágulo completo.

Este trabajo tiene como objetivo comprender cómo las plaquetas activadas impulsan la contracción del coágulo e influyen en la dinámica general del proceso a través de alteraciones en las fuerzas de tracción ejercidas por sus filopodios, que son los principales elementos estructurales y mecánicamente activos de una plaqueta en contracción. Un concepto importante que subyace al modelo presentado en este artículo es la existencia de retroalimentación biomecánica entre la contractilidad de las plaquetas individuales (o filopodios) y el endurecimiento por tensión de la matriz de fibrina (o fibras de fibrina individuales)9,14,15. En particular, el modelo desarrollado por nuestro grupo emplea un enfoque de modelado computacional 3D, en el que el grado de activación plaquetaria se puede representar alterando el número de filopodios por plaqueta y la magnitud de la fuerza ejercida por cada filopodo. Es importante destacar que la fuerza de tracción generada por los filopodios está modulada por la respuesta mecánica al cambio de rigidez de las fibras de fibrina bajo tensión. Esta metodología permite la representación cuantitativa de diferentes mecanismos de activación plaquetaria a escala microscópica y la predicción de las propiedades globales resultantes del coágulo sanguíneo, como el alcance y la cinética de la contracción del coágulo a nivel macroscópico (consulte la sección "Descripción del modelo"). .

Las propiedades mecánicas de los coágulos sanguíneos se han estudiado ampliamente y se ha demostrado que dependen de la viscoelasticidad de sus componentes principales, es decir, fibrina, plaquetas y glóbulos rojos, así como de la interacción estructural y mecánica del coágulo7,17,27,28,29,30 ,31. La fibrina desempeña un papel clave al proporcionar estabilidad mecánica a un coágulo al formar una red, un andamio que propaga las tensiones externas generadas por el flujo sanguíneo o las fuerzas extravasculares, así como por las fuerzas de tracción de las plaquetas activadas durante la contracción del coágulo29,32,33,34. Las redes de fibrina revelan un comportamiento de rigidez notable al estirarse y cortarse y una transición de ablandamiento-rigidez bajo compresión29,32,33,34. Las fibras de fibrina individuales exhiben un comportamiento elastomérico, lo que indica un módulo elástico bajo (~MPa) y al mismo tiempo son extremadamente extensibles (>300% de tensión)35. La propensión de los coágulos de fibrina a romperse se ha estudiado mediante análisis termodinámico y estructural36 y se ha cuantificado en términos de la tasa crítica de liberación de energía37,38.

Las plaquetas desempeñan un papel clave en la contracción del coágulo o en la reducción del volumen del coágulo al ejercer fuerzas de tracción sobre las fibras circundantes, lo que provoca la compactación de la fibrina en las proximidades de las plaquetas individuales, lo que lleva a la densificación local de la fibrina en un coágulo que aumenta drásticamente la densidad de la red y la rigidez del coágulo16. Se midió que la fuerza contráctil máxima promedio generada por una plaqueta individual era 29 nN17. La contracción del coágulo va acompañada de reordenamientos estructurales espectaculares, de modo que los glóbulos rojos se concentran estrechamente en la parte interior, mientras que una red de fibrina y plaquetas se acumula en el exterior del coágulo2,39. Estos cambios estructurales resultan de una interacción física entre las plaquetas contráctiles mecánicamente activas y los elementos viscoelásticos pasivos (glóbulos rojos, fibrina) del sistema biomecánico complejo y dinámico16,40. La contracción del coágulo tiene varias fases cinéticas que dependen de la composición molecular y celular de la sangre en la que se forma el coágulo41. La presencia de glóbulos rojos (RBC) altera la cinética de contracción del coágulo y da como resultado la formación de eritrocitos (poliedrocitos) de tipo poliédrico muy empaquetados que forman una barrera impermeable en los coágulos y trombos contraídos42.

Los modelos teóricos y computacionales anteriores de la contracción de los coágulos sanguíneos, aunque investigaron el papel de los componentes principales y los aspectos mecánicos importantes26,40,43,44,45,46,47,48,49, no proporcionaron una descripción de los detalles estructurales, como la fibrina. organización de la red y plaquetas individuales incrustadas en la red50. A pesar de importantes conocimientos termodinámicos40, las fuerzas impulsoras y los mecanismos de reordenamiento estructural de los coágulos sanguíneos que se contraen no se comprenden bien. Recientemente se utilizaron varios modelos computacionales para estudiar estos procesos18,51, centrándose especialmente en el comportamiento asincrónico o asimétrico de las plaquetas en un coágulo que se contrae. Además, trabajos anteriores43 introdujeron un importante modelo basado en partículas dinámicas moleculares de grano grueso para estudiar la formación de un filópodo individual durante las primeras etapas de la activación plaquetaria.

La principal novedad del enfoque de modelado computacional multiescala tridimensional (3D) descrito en este artículo es su representación detallada de la funcionalidad plaquetaria que involucra filopodios en diversos grados de activación, con las correspondientes alteraciones estructurales y mecánicas locales a microescala que tienen un impacto acumulativo a macroescala en la contracción de todo el coágulo de sangre. El modelo combina un submodelo a microescala del mecanismo de "tirar de una cuerda con las manos" de un filópodo que tira de una fibra de fibrina en función de la rigidez de la fibra, con submodelos de una fibra de fibrina individual y una red de fibrina completa. Además, en este artículo, estudiamos el proceso de contracción con números variables de filopodios por plaqueta, ya que anteriormente se pensaba que los filopodios realizaban principalmente una función sensorial52,53, mientras que los lamellipodios participan más comúnmente en la generación de fuerza.

Específicamente, el trabajo actual describe en detalle la remodelación de la red de fibrina y la acumulación de fibrina cerca de la superficie de cada plaqueta activada durante la contracción del coágulo. Además, la mayoría de los modelos anteriores de mecánica de biogeles se diseñaron para simular el estiramiento y la deformación de biogeles mediante fuerzas aplicadas externamente sobre sus superficies. (Para ver un ejemplo de un modelo que describe el estiramiento de una red de fibrina por fuerzas externas, consulte la referencia 30.) Hasta donde sabemos, el modelo, descrito en el artículo actual, es el primero en implementar en detalle las fuerzas internas ejercidas. individualmente por una gran cantidad de células (plaquetas activadas) ubicadas dentro de una red y tirando de fibras individuales y condensando localmente la fibrina y contrayendo la red. Esto introduce complejidad y relevancia biológica, permite calibrar el modelo utilizando datos experimentales específicos y da como resultado simulaciones de modelos predictivos específicos.

El diagrama de la Fig. 2 proporciona una descripción del acoplamiento de todos los submodelos a escalas específicas en un marco computacional multiescala tridimensional (3D) para simular la contracción del coágulo. La Figura 2 también proporciona resultados predictivos específicos obtenidos mediante el uso de una combinación de simulaciones y experimentos de modelos biológicamente calibrados. Los rangos específicos de valores de parámetros se proporcionan en la Tabla complementaria 1. Este modelo multiescala combina un modelo 3D de una red de fibrina con un submodelo detallado que representa un filópodo de una plaqueta individual que tira de una fibra de fibrina y la condensa localmente (recuadro de la Fig. 3a). ). Las fibras de fibrina individuales se describen utilizando un enfoque de modelado de masa y resorte, que incluye estiramiento y flexión de fibras (Fig. 3b) e interacciones cohesivas fibra-fibra (Fig. 3c) (consulte también la Nota complementaria 1 para obtener detalles adicionales del modelo y la Tabla 1 para rangos de valores de parámetros). La configuración inicial de las fibras de fibrina y plaquetas modelo está dispuesta para representar un coágulo esférico de 23,8 µm de radio (consulte la Nota complementaria 2). Estas configuraciones se generan para preservar propiedades medibles experimentalmente, como la densidad de fibrina y plaquetas, y una porción de fibrina colocalizada en plaquetas (consulte las Notas complementarias 2.1 a 2.3).

Los submodelos de microescala y mesoescala de fenómenos de menor escala se ensamblan como componentes y luego se calibran para crear un modelo capaz de simular datos en las escalas micro, meso y macro.

Una instantánea de un modelo de representación de una red de fibrina (líneas) y plaquetas (esferas). (recuadro) Las zonas de influencia incluyen la zona de interacción de los filopodios (región 1), la zona adhesiva (región 2) y una zona de volumen de plaquetas que representa el cuerpo de las plaquetas (región 3). Las flechas indican si las fuerzas aplicadas a las fibras actúan hacia el centro de la plaqueta o alejándose del centro. b Se modela una sola fibra de fibrina utilizando varios resortes de subsegmento de cadena tipo gusano (WLC) y resortes de flexión. La segmentación de la fibra en varios resortes está indicada por subnodos. Aquí los puntos i y j son los nodos principales (por ejemplo, puntos de ramificación, nodos negros más grandes) de la fibra, mientras que los puntos entre i y j (por ejemplo, p y n) son subnodos computacionales, y los segmentos entre los subnodos son los Subsegmentos de resorte WLC (ver ejemplo con halo naranja). c Diagrama de la formación de un enlace cohesivo entre fibras suficientemente cercanas (byc fueron modificados de la literatura30 con permiso de Elsevier para incluir imágenes de nuevos componentes del modelo).

Basado en el modelo anterior30 desarrollado por nuestro grupo, cada fibra de fibrina se representa como un segmento entre dos nodos (puntos de ramificación en una red de fibrina 3D) y se divide por subnodos (puntos virtuales creados arbitrariamente) en subsegmentos de fibras equidistantes. longitud de 0,3 µm modelados como resortes elásticos de cadena tipo gusano no lineales (Fig. 3b). Los subsegmentos consecutivos también tienen fuerzas de flexión modeladas mediante resortes de flexión lineales. Finalmente, los segmentos de fibra pueden formar enlaces cohesivos (contactos entrecruzados u oblicuos) cuando dos fibras/segmentos no paralelos se acercan y se tocan (Fig. 3c, consulte la Nota complementaria 1.1 y el trabajo anterior30 para obtener más detalles).

La dinámica de los nodos y subnodos de fibra se describe mediante una ecuación de Langevin en un régimen sobreamortiguado:

donde \({x}_{{\rm {f}},j}\) es el vector de posición del jésimo nodo de fibra, \({F}_{{\rm {f}},j}\) es la fuerza determinista que actúa sobre el nodo o subnodo de la fibra j (fuerzas elásticas de fibrina, fuerzas de flexión y fuerzas de interacción fibrina-plaquetas, que se analizan a continuación; consulte la Nota complementaria 1.1 para obtener más detalles), \({\eta }_{{\rm {f}}}\) representa el coeficiente de arrastre para un nodo de fibra en suero líquido, y \({F}_{j}^{{{B}}}\) es la fuerza browniana debida a las fluctuaciones térmicas (consulte el suplemento Notas 1.1 para más detalles). La formación de enlaces de cohesión en lugar del principio de exclusión de volumen en nuestro modelo evita que las fibras de fibrina se crucen entre sí (consulte la Nota complementaria 1.1 y la referencia 30 para obtener más detalles).

La constante de resorte Bs de los resortes de flexión se calcula usando la relación Bs = EI, donde E es el módulo de Young, que se determinó ajustando las fuerzas de la cadena tipo gusano a los datos de AFM de la literatura54 (consulte la figura complementaria 1). El parámetro \(I\) es el momento de inercia de un círculo. Consulte la Nota complementaria 3.1 para obtener más detalles sobre el cálculo, que conduce a Bs = 2,252 × 10−3 nN μm2.

La masa relativamente pequeña de fibrina y plaquetas, y los medios circundantes relativamente viscosos (es decir, un ambiente con un número de Reynolds bajo (<<1)) hacen que sea razonable suponer que la dinámica de los nodos individuales está sobreamortiguada como en la ref. 30, por lo que el término de inercia se omite en el sistema (1). Luego, el sistema (1) se discretiza y se resuelve utilizando un esquema de Euler directo:

En las Notas complementarias 1.1 y 1.3 se proporciona una discusión más detallada de las fuerzas, los coeficientes y la calibración del modelo.

Cada plaqueta interactúa con las fibras de fibrina a través de protuberancias adherentes llamadas filopodios, lo que provoca la contracción del coágulo a medida que los filopodios atraen las fibras de fibrina hacia el cuerpo celular. Esto, a su vez, conduce a la remodelación de la red de fibrina, lo que provoca su acumulación cerca de la superficie de las plaquetas y la densificación de la red de fibrina, que son las características estructurales más importantes de la contracción del coágulo. Como resultado de la compactación de la red de fibrina, algunas plaquetas adheridas a fibrina se acercan pasivamente entre sí y forman grupos secundarios.

La dinámica de las plaquetas se describe en términos de las siguientes ecuaciones de Langevin. Es decir, el movimiento del centro de masa de la i-ésima plaqueta se describe mediante las siguientes ecuaciones diferenciales ordinarias:

donde \({F}_{{\rm {p}},i}\) es la suma de las fuerzas deterministas aplicadas a la iésima plaqueta. Estas fuerzas incluyen interacciones fibrina-plaquetas o plaquetas-plaquetas (que se describen a continuación y se encuentran más detalles en las Notas complementarias 1.1 a 1.3). La fuerza de amortiguación viscosa, debida al coágulo que se llena con suero, está representada por \({\eta }_{{\rm {p}}}{\dot{x}}_{{\rm {p}}, i}\) y \({F}_{i}^{{\rm {B}}}\) denota la fuerza browniana debida a fluctuaciones térmicas55 (consulte también la Nota complementaria 1.1 para obtener más detalles). Se supone que el sistema está en un régimen sobreamortiguado como en Britton et al. 30. Por lo tanto, se desprecia el término inercial y el sistema (3) se discretiza en el tiempo utilizando un esquema de Euler directo:

donde los superíndices \(n\) y \(n+1\) se refieren a las cuantificaciones vectoriales en los pasos de tiempo \(n\) y \(n+1\) para la iésima plaqueta y \({{\rm {d }}t}\) es el paso de tiempo; \({\eta }_{{\rm {p}}}\) representa el coeficiente de arrastre de una plaqueta con volumen fijo en plasma.

Los filopodios de las plaquetas activadas son protuberancias de la membrana celular impulsadas por el citoesqueleto que pueden unirse a las fibras de fibrina y atraerlas hacia las plaquetas16. La unión y la tracción fibrina-plaquetas son las interacciones más importantes en las simulaciones del modelo y el principal mecanismo que impulsa la contracción del coágulo. En el modelo, el cuerpo de cada plaqueta activada se representa como una esfera de radio \({r}_{\rm {{p}}}\) (Fig. 4, regiones 2 y 3). Además, la plaqueta extiende los filopodios en la región entre la superficie del cuerpo de la plaqueta (esfera de radio \({r}_{{\rm {p}}}\)) y la superficie de una esfera de radio \({r }_{{\rm {p}}}+{r}_{{{\rm {fil}}}}\) (Fig. 4, región 1, también conocida como zona de interacción de filopodios), donde \({ r}_{{{\rm {fil}}}}\) representa la longitud máxima de filopodios en simulaciones. Los filopodios pueden unirse a fibras de fibrina y otras plaquetas dentro de la zona de interacción de los filopodios. Se utiliza una geometría esférica porque las plaquetas son células no polares, por lo que los cambios de forma y las fuerzas ejercidas por las plaquetas activadas en su entorno cercano son isotrópicas.

Esquema de un modelo de representación de una plaqueta individual que interactúa con fibras de fibrina (líneas negras) en un coágulo. Se aplican diferentes fuerzas (flechas) a los nodos o subnodos de las fibras (puntos negros) dependiendo de la distancia desde el centro de masa de las plaquetas. Las flechas azul marino representan los filopodios de las plaquetas tirando de nodos de fibra seleccionados al azar dentro de \({r}_{{\rm {{fil}}}}\) de la superficie de las plaquetas (es decir, dentro de la zona de interacción de los filopodios, región 1). Aquí \({r}_{\rm {{p}}}\) es el radio de la plaqueta (esférica) y la fracción \({f}_{\rm {{r}}}=0.9\) es se utiliza para distinguir la zona adhesiva que atrae la fibrina (región 2) con fuerzas adhesivas (flecha amarilla que tira con fuerza \({F}_{0}\) del cuerpo de las plaquetas (región 3), cuyo volumen excluye la fibrina al expulsarla a través de un potencial de Lennard Jones \({F}_{{\rm {{LJ}}}}\). Las expresiones detalladas de las fuerzas se proporcionan en la Nota complementaria 1.1, ecuaciones (5) a (8).

Cada plaqueta en el modelo tiene varios filopodios que varían entre 2 y 13 (número máximo observado en experimentos16, ver también Fig. 5). El número de cada plaqueta individual se determina mediante una variable aleatoria discreta generada a partir de una distribución logarítmica normal truncada obtenida mediante ajuste con recuentos experimentales de filopodios por plaqueta activada (ver Fig. 5). Cada filópodo solo puede conectarse con una fibra de fibrina, tirando así de un nodo o subnodo durante la contracción. Esto sucede si un nódulo o subnódulo de fibrina ingresa a la región cercana a las plaquetas donde los filopodios pueden extenderse (Fig. 4, región 1) y al menos un filópodo está disponible pero aún no está adherido. En las simulaciones, se considera que un nodo o subnodo de una fibra de fibrina ingresa a esta región si la distancia entre el centro de masa del nodo o subnodo y la plaqueta \({d}_{{\rm {{ fp}}}}\) satisface \({{r}_{\rm {{p}}} \, < \, {d}_{{\rm {{fp}}}} \, < \, r }_{\rm {{p}}}+{r}_{{{\rm {fil}}}}+{r}_{{{\rm {fib}}}}\), donde \({ r}_{{{\rm {fib}}}}=0.05\,{\rm {\mu {m}}}\) es el radio de una fibra de fibrina30,54,56. En el modelo se simulan cientos de fibras correspondientes a cientos de segmentos, sumando decenas de miles de nódulos y subnodos de fibrina, mientras que la densidad de plaquetas utilizada corresponde a 45 plaquetas en las simulaciones, lo que hace que las interacciones fibrina-plaquetas sean mucho más probables que Interacciones plaquetas-plaquetas para la contracción del coágulo simulada con el modelo.

Las funciones de densidad de probabilidad del número de filopodios por plaqueta en 10 coágulos simulados se validaron utilizando datos experimentales específicos y en cuatro mallas de plaquetas-fibrina obtenidas experimentalmente.

Cuando un filópodo se adhiere a un nódulo o subnodo de fibrina, se aplican fuerzas a lo largo de la dirección que conecta los centros de masa de las plaquetas que extienden el filópodo y el nódulo o subnodo de fibrina. La fuerza ejercida por el filópodo se aplica al centro de masa del nódulo o subnodo de fibrina hacia el centro de masa de las plaquetas extendiendo el filópodo (ver flechas en la Fig. 4). También se aplica una fuerza de reacción correspondiente al centro de masa de la plaqueta extendiendo el filópodo en la dirección opuesta. Los filopodios atraen los nodos o subnodos de las fibras hacia las plaquetas con una fuerza, \({F}_{\rm {{p}}}\), cuando están en la zona de interacción de los filopodios (Fig. 4, región 1). ). Una fuerza de adhesión constante (dirigida hacia las plaquetas), \({F}_{0}\), que representa la adhesión entre las fibras y la superficie de las plaquetas, se aplica a los nodos o subnodos de las fibras cuando ingresan a la zona adhesiva (región 2). ). Se aplica una fuerza repelente de Lennard-Jones, \({F}_{{\rm {{LJ}}}}\) a los nodos y subnodos de las fibras y a las plaquetas cuando ingresan al volumen de plaquetas (región 3) para hacer cumplir la exclusión de volumen evitando que las plaquetas o las fibras de fibrina se superpongan con la plaqueta dada. Cuando las fibras entran en esta región, la fuerza de Lennard-Jones las aleja del centro de masa de la plaqueta.

Las simulaciones de modelos se realizan bajo el supuesto de que una vez que un filópodo se adhiere a una fibra de fibrina, la fuerza de tracción de un filópodo, \({F}_{{\rm {p}}}\), depende de la rigidez local de la fibra. en cada nodo o subnodo extraído. Específicamente, la fibrina es un material que refuerza la tensión. Por lo tanto, en nuestro modelo, la deformación local promedio de la fibra en el nodo o subnodo que se está tirando se utiliza para calcular la rigidez local (consulte la Nota complementaria 3.1 y la Tabla complementaria 2 para la calibración del submodelo de fibra única).

Para cada nodo o subnodo de una fibra tirada por un filópodo, la deformación local de la fibra, \(\bar{\gamma }\), se calcula como la deformación promedio de todos los subsegmentos que incluyen ese nodo o subnodo. . Entonces \(\bar{\gamma }\) es la tensión de la fibra utilizada por el filópodo para producir una fuerza de tracción. La rigidez local promedio de una fibra unida a un filópodo (nodo o subnodo) se calcula de la siguiente manera: \(k=\frac{{\rm {d}}{F}_{{{\rm {WLC} }}}(\bar{\gamma })}{\bar{d\gamma }}\).

Se ha adaptado la siguiente fórmula a datos experimentales para aproximar la fuerza contráctil ejercida por una plaqueta completa:

Aquí, \(t\) es el tiempo transcurrido desde el inicio de la contracción (es decir, el inicio de la simulación) del coágulo y \({f}_{0},{a},{b},{c}, {d},\,\tau\) son valores de parámetros determinados ajustando datos experimentales17 (consulte la Nota complementaria 3.2, la Tabla complementaria 3, la Fig. 3 complementaria y la Tabla 1 para obtener más detalles y valores de parámetros utilizados en las simulaciones). La fórmula (5) considera tanto el tiempo de carga exponencial observado previamente17 como el aumento monótono y la saturación de la fuerza celular contráctil. Esto es similar a lo que se observó en la ref. 57, donde se demostró que las fuerzas de las células madre tienen una dependencia comparable de la rigidez de la matriz extracelular circundante. Sin embargo, el presente modelo incluye un submodelo que representa la fuerza de tracción de un solo filópodo, y en este momento no hay datos experimentales disponibles que caractericen dicha fuerza. En cambio, probamos varias expresiones hipotéticas para derivar y calibrar la fuerza de tracción de un solo filópodo \({F}_{{{\rm {filópodo}}}}\) de \({F}_{{{\rm { plaquetas}}}}\) (para más detalles, consulte la Nota complementaria 3.2; la comparación con los datos experimentales se proporciona en la Nota complementaria 4.3).

La función de la fuerza de tracción del filópodo que produjo la mejor y muy buena concordancia con los datos experimentales viene dada por la siguiente fórmula:

Durante la contracción de los filopodios, la fuerza aplicada actúa sobre los nódulos o subnodos de fibrina de una fibra de fibrina solo mientras \({{r}_{{\rm {p}}} \, < \, {d}_{{{\ rm {fp}}}} \, < \, r}_{{\rm {p}}}+{r}_{{{\rm {fil}}}}+{r}_{{{\rm {mentira}}}}\). Cuando estas condiciones no se cumplen, el filópodo se desprende de la fibra de fibrina. Para las interacciones plaquetas-fibrina, si la distancia entre los ganglios, subnódulos y una plaqueta de fibrina satisface \({{d}_{{{\rm {fp}}}} \, < \, r}_{{ \rm {p}}}\), primero se aplica una fuerza adhesiva y luego una fuerza de exclusión de volumen (detallada en la siguiente subsección). Además, después de la interacción entre un filópodo y una fibra de fibrina, una vez que se desprende el filópodo, se vuelve a unir y comienza a tirar del siguiente nodo o subnodo de la fibra de fibrina. Este componente de modelado reproduce el mecanismo de “tirar de una cuerda mano sobre mano” observado anteriormente16. Si no existe ningún nuevo nódulo o subnodo de fibrina (p. ej., nódulo terminal de una fibra), los filopodios quedan libres y fluctúan para conectarse con otras fibras disponibles.

Actualmente no existe evidencia experimental para distinguir entre el tirón posterior de una fibra por parte de diferentes filopodios plaquetarios y el tirón repetido de una fibra por el mismo filopodo. Sin embargo, es poco probable que esta diferencia en la tracción de los filopodios sea de importancia crítica para la contracción del coágulo desde un punto de vista biomecánico, ya que las plaquetas en ambos casos realizan la misma cantidad de trabajo para acortar y compactar las fibras, lo que por lo tanto no afecta los resultados del modelo.

Durante la contracción del coágulo, cada plaqueta atrae las fibras de fibrina hacia su centro de masa. En el modelo, se utiliza una fracción del radio de las plaquetas, \({f}_{\rm {{r}}}=0,9\), para indicar el límite de la zona adhesiva. Si la distancia entre un centro plaquetario y un nódulo o subnodo de fibrina satisface \({{f}_{{\rm {r}}}\cdot r}_{{\rm {p}}}+{r} _{{\rm {f}}} \, < \, {d}_{{{\rm {fp}}}} \, < \, {r}_{{\rm {p}}}+{ r}_{{\rm {f}}}\), entonces la fibra está dentro de la Zona Adhesiva que rodea la plaqueta. Cuando una fibra de fibrina está dentro de la zona adhesiva de una plaqueta activada, el modelo aplica una fuerza constante fija, \({F}_{0}\), a los centros de masa de los nodos o subnodos de fibrina dirigida hacia el Centro de masa de las plaquetas. La fuerza de la zona de adhesión es parte de la tracción de las plaquetas generada por la maquinaria de actomiosina plaquetaria, mediante la cual la contractilidad se transmite a las fibras de fibrina a través de las integrinas plaquetarias. La fuerza contráctil se ha medido para plaquetas individuales utilizando diferentes métodos experimentales descritos en las referencias. 58,59,60. Estimamos que el valor mínimo de \({F}_{0}\) de la figura complementaria 2 es 4 nN. La zona adhesiva para las plaquetas se muestra en las Figs. 3a y 4 (región 2). Esta fuerza tiende a acercar las fibras de la zona adhesiva al centro de masa de la plaqueta. Una vez \({{d \, < \, f}_{{\rm {r}}}\cdot r}_{{\rm {p}}}+{r}_{{\rm {f}} }\), para los nodos y subnodos de fibra se debe considerar la mecánica 3D. Específicamente, para reflejar el papel de un cuerpo plaquetario, se introduce una fuerza repulsiva que empuja las fibras de fibrina lejos de las plaquetas. Este tipo de fuerza a menudo se denomina fuerza de exclusión de volumen61 y se aplica a los ganglios y subnódulos de fibrina en la dirección opuesta, es decir, lejos de las plaquetas que interactúan. Esta zona de volumen de plaquetas está ilustrada por la región 3 en las Figs. 3a y 4. La magnitud de la fuerza se calcula utilizando una fuerza estándar basada en el potencial de Lennard-Jones \({F}_{{{\rm {LJ}}}}=12\epsilon ({\sigma }^{12}/ {x}^{13}-{\sigma }^{6}/{x}^{7})\), donde \(\sigma =2{{f}_{{\rm {r}}}r }_{{\rm {p}}}/{2}^{1/6}\), \(\epsilon =16\,{\rm {{nN}}}\cdot {\rm {\mu m }}\) y \(x={d}_{{{\rm {fp}}}}\,{{\rm {o}}}\,{d}_{{{\rm {pp}} }}\) (consulte también la Nota complementaria 1.1 para obtener detalles sobre el parámetro). Dado que el marco del modelo puede potencialmente dejar algunos filopodios sin enganchar, y el número de filopodios por plaqueta se calibró con el número de filopodios que tiran activamente, es importante tener en cuenta que en nuestras simulaciones todos los filopodios disponibles participaron activamente en tirar de las fibras de fibrina.

Se introdujeron varias técnicas computacionales para acelerar y optimizar una gran cantidad de simulaciones de modelos. Primero, el código de simulación se implementó usando CUDA para aprovechar al máximo la paralelización de GPU. Todas las operaciones independientes se realizan en paralelo utilizando la biblioteca de algoritmos paralelos CUDA Thrust para optimizar el número de bloques y subprocesos. La sincronización de subprocesos de GPU está diseñada específicamente para evitar la carrera de datos. Dado que todos los filopodios y fibras deben interactuar en las simulaciones, se utilizan dos cuadrículas de células tridimensionales de diferentes resoluciones para construir mapas de vecinos más cercanos. Este método de cuadrícula reduce el costo de la interacción de elementos de O(n2) a O(n), lo que resulta en escalabilidad y un aumento del tiempo de ejecución casi lineal con respecto al recuento de elementos. Comentarios adicionales sobre el costo computacional del modelo y la paralelización de GPU están disponibles en la Nota complementaria 1.4. La ejecución del análisis de sensibilidad requiere de cientos a decenas de miles de simulaciones de modelos (por ejemplo, métodos basados ​​en la varianza como los índices de Sobol; PRCC o eFAST62,63), lo que actualmente es computacionalmente demasiado costoso. Por lo tanto, restringimos nuestros análisis a aquellos parámetros libres que hemos identificado como con mayor probabilidad de tener el mayor impacto biológico. Los resultados presentados en las figuras de la sección "Resultados" se obtuvieron promediando mediciones de 10 coágulos simulados. Las cifras representan tanto la media como la desviación estándar de cada métrica de salida calculada a partir de estas simulaciones. Podemos ver que la desviación estándar es aceptable.

Observamos que tanto nuestro modelo como los modelos descritos en la literatura20,51 están desarrollados para estudiar la contracción del coágulo de fibrina y pueden parecer similares. Por ejemplo, ambos modelos emplean una representación de grano grueso de fibras de fibrina. Sin embargo, los modelos publicados fueron diseñados para abordar principalmente aspectos especiales de la contracción del coágulo, la heterogeneidad plaquetaria y la relación entre las fuerzas generadas por las plaquetas individuales y la fuerza contráctil general. Además, a pesar de algunas similitudes aparentes, los modelos20,51 utilizan dinámica de partículas disipativas para incluir el efecto del fluido (viscosidad), mientras que nuestro modelo tiene en cuenta la interacción fibra-fluido mediante la introducción de una fuerza amortiguadora viscosa y la fluctuación térmica de los nodos mediante la fuerza browniana. Los modelos20,51 representan la elasticidad de fibras individuales como resortes armónicos, mientras que nuestro modelo utiliza un enfoque no lineal en forma de cadena de gusano. Los valores de los parámetros de la cadena tipo gusano se obtienen ajustando mediciones de experimentos de microscopía de fuerza atómica. Dado que una fibra de fibrina exhibe perfiles de fuerza-deformación no lineales, la cadena tipo gusano no lineal representa con precisión la relación de tensión-deformación local, que a su vez afecta la cantidad de fuerza que una plaqueta puede imponer sobre una fibra. Los modelos en la literatura20,51 aplican energías de exclusión de volumen a nodos de fibras individuales para evitar que se superpongan y no formen enlaces de cohesión entre las fibras después de la inicialización de las simulaciones. Nuestro modelo forma dinámicamente enlaces de cohesión cuando dos fibras están cerca una de la otra para evitar que se crucen. Estos modelos20,51 dan a cada plaqueta exactamente 12 filopodios, cada uno de los cuales tira con una fuerza lineal sobre las fibras cercanas (es decir, fuerza proporcional a la contracción del coágulo). Nuestro modelo utiliza una distribución probabilística para el número de filopodios determinado utilizando datos experimentales.

La densificación local de la fibra mediante la extracción de plaquetas se modela de manera diferente en estos modelos. Nuestro trabajo captura la densificación mediante dos indicadores. En primer lugar, está la evolución temporal general del área de fibrina colocalizada con plaquetas y, en segundo lugar, es la formación de grupos de plaquetas que se observa que coinciden con la densificación local de la fibrina. Otros modelos20,51 miden la densificación de la red de fibra por proxy de volumen y área de sección transversal. En las simulaciones, otra diferencia entre el trabajo51 y este artículo es que observamos la contracción del coágulo y la agrupación de plaquetas y determinamos la contracción de un coágulo en estados casi estacionarios; el marco iClot51 analiza la fuerza emergente a macroescala que su coágulo aplica a las paredes límite y el impacto en el volumen del coágulo de la asincronía temporal de la contracción plaquetaria. El artículo anterior20 también analiza el área transversal de los coágulos y la concentración de enlaces cruzados (es decir, la evolución de la concentración volumétrica de un número estático de uniones fibrina-fibra) como una medida de la contracción. Por el contrario, medimos la agrupación de plaquetas directamente desde la simulación a través de ubicaciones de plaquetas individuales. Ambos artículos20,51 representan sistemas con coágulos fijados a dos límites fijos, mientras que nuestras simulaciones tienen límites libres.

Se realizaron simulaciones para coágulos esféricos con un radio de 23,8 µm, elegidos por ser biológicamente relevantes y lo más grandes posible en la práctica para finalizar las simulaciones en un tiempo razonable. Como se describe en la sección "Métodos", se probaron varias formas de fuerzas de tracción de filópodos y se seleccionó el dato experimental que mejor se ajustaba (consulte las Notas complementarias 3.2 y 4.3 para obtener más detalles). Para cada forma de fuerza, realizamos 10 simulaciones de contracción de coágulos con valores de parámetros fijos indicados en la Tabla 1 con estructuras iniciales de coágulos generadas de forma independiente. En la Fig. 6 se proporcionan las desviaciones promedio y estándar para cada métrica de contracción. Estas simulaciones de coágulos involucran 45 plaquetas esféricas incrustadas en redes de fibrina y se ejecutan durante 30 minutos de tiempo de contracción real. Cada coágulo se generó computacionalmente con una densidad plaquetaria promedio de 800.000 plaquetas/mm3, correspondiente a una concentración de plaquetas en plasma rico en plaquetas (el doble del recuento de plaquetas normal más alto en sangre completa para tener en cuenta el volumen de eritrocitos)64, y un volumen de fibrina del 0,3 %. fracción correspondiente a una concentración masiva normal de fibrinógeno en plasma 0,2-0,4%65.

Los resultados de la simulación se muestran con líneas discontinuas azules, mientras que las líneas continuas negras representan datos experimentales16. Las regiones sombreadas representan el intervalo entre la media más una desviación estándar y la media menos una desviación estándar. a Área normalizada de fibrina colocalizada en plaquetas, \({f}_{{\rm {p}}}/{f}_{{\rm {p}}}^{0}\), durante la contracción del coágulo. b Densidad de fibrina normalizada, \({f}_{{\rm {d}}}{/f}_{{\rm {d}}}^{0}\) en función del tiempo. c Cambios en la densidad de fibrina, \({\varDelta f}_{{\rm {d}}}\) durante la contracción del coágulo (la primera derivada de \({f}_{{\rm {d}}}{/ f}_{{\rm {d}}}^{0}\)). Los resultados se presentan como M ± STD de 10 simulaciones (consulte también la Nota complementaria 4.1 y la Fig. 4 complementaria para obtener detalles sobre los cálculos de la fase de contracción).

La fracción de fibrina inicializada cerca de las plaquetas, \({P}_{{{\rm {fnp}}}}\), se fijó en 0,5 (ver Nota complementaria 2.1), ya que esta era la fracción correspondiente a redes simuladas que eran más cualitativamente como los de los experimentos. Tenga en cuenta que estas densidades de fibras y densidades de plaquetas, dentro del volumen de coágulo elegido, dan como resultado más de 60.000 posibles puntos de unión (nódulos y subnódulos) para filopodios en fibras de fibrina. La distancia interplaquetaria inicial promedio en nuestras simulaciones es de 25 micras. Por lo tanto, las interacciones entre plaquetas son raras y solo ocurren una vez que dos plaquetas se acercan mucho entre sí durante la densificación de la red durante la contracción del coágulo. En la Fig. 5 se muestra la distribución de los recuentos de filopodios por plaqueta de cuatro experimentos independientes que obtienen imágenes y analizan más de 400 plaquetas como rectángulos de color gris claro. La distribución lognormal ajustada (\(\mu =1.85\),\(\sigma =0.27\)), utilizada en las simulaciones, se muestra como rectángulos de color gris oscuro. Los recuentos de filopodios de plaquetas simulados utilizados en las simulaciones se obtuvieron muestreando esta distribución lognormal ajustada utilizando las distribuciones observadas experimentalmente (como se describe en la sección "Métodos").

El número de filopodios depende del grado de activación plaquetaria y de la dinámica citoesquelética, independientemente de la cantidad de fibrina circundante. La unión plaquetas-fibrina es probabilística: cuanto mayor es la densidad de fibrina y más filopodios se forman, más probable es que interactúen. El modelo implica que todos los filopodios están involucrados y esto es una simplificación razonable. Además, dado que no hay muchos datos disponibles en términos de la distribución precisa de qué fibras unen las plaquetas a sus filopodios, les permitimos elegir aleatoriamente entre las fibras que están a su alcance. Nuestro marco modelo puede ampliarse fácilmente para dar cabida a hipótesis alternativas sobre cómo las plaquetas podrían elegir qué fibras tirar.

Para validar el modelo, se compararon simulaciones de contracción del coágulo con datos experimentales de Kim et al. 16 utilizando varias métricas apropiadas para cuantificar la contracción del coágulo a lo largo del tiempo (Fig. 6). Las métricas utilizadas en las figuras 6a a c incluyen el área relativa de fibrina colocalizada en plaquetas en la superficie de las plaquetas simuladas (es decir, la fracción de fibrina que se encuentra dentro de las zonas 2 o 3 de cualquier plaqueta como se describe en la figura 4). f}_{\rm {{p}}}\); densidad de fibra de fibrina, \({f}_{\rm {{d}}}\); y cambio en la densidad de fibrina, \(\varDelta {f}_{\rm {{d}}}\). La Figura 6 muestra que los resultados simulados están dentro de una única región de desviación estándar de las mediciones experimentales. En particular, el modelo predice correctamente un aumento en la cantidad de fibrina acumulada por las plaquetas individuales debido a su tracción sobre las fibras de fibrina y su compactación (Fig. 6a). Los cambios calculados en la densidad de fibrina revelan un aumento de 1,4 veces después de 30 minutos de contracción, lo que concuerda con los datos experimentales (Fig. 6b).

Estos resultados comparativos proporcionan la validación del modelo propuesto de contracción del coágulo. En estudios experimentales previos16, se observaron tres fases cinéticas distintas en la contracción del coágulo. Estos son el período de “precontracción” o de retraso (fase P1), la “contracción activa” (fase P2) y la “contracción final” (fase P3). Los cambios en la primera derivada de la función de densidad de fibrina con respecto al tiempo indican tres fases cinéticas en coágulos de plaquetas y fibrina que se contraen tanto in vitro como in silico (consulte la Fig. 6c y la Nota complementaria 4.1).

Los tiempos de cambio de una fase a otra se identifican por los dos picos principales en los cambios de densidad de fibrina (máximos en la figura complementaria 4), lo que implica tres fases cinéticas de contracción del coágulo, anteriormente denominadas "precontracción", "activa". y etapas de contracción “finales”16. Sorprendentemente, los límites de la fase cinética para el coágulo modelo en t = 3,0 ± 1,0 min y t = 33,0 ± 1,0 min están muy cerca de los límites temporales para los coágulos experimentales en t = 4,2 ± 1,2 min y t = 29,4 ± 1,2 min. Las tasas cinéticas (es decir, el cambio promedio de densidad de fibrina durante una fase) de las tres fases de contracción consiguientes calculadas en el modelo: k1 = 0,015/s, k2 = 0,010/s y k3 = 0,011/s, también concuerdan parcialmente con los valores experimentales correspondientes k1 = 0,024/s, k2 = 0,011/s, k3 = 0,0044/s. En particular, la velocidad cinética de las fases "activas" tanto para experimentos como para simulaciones es casi idéntica.

Para validar aún más el modelo, realizamos experimentos de una contracción macroscópica de un coágulo de plasma rico en plaquetas en ausencia y presencia de blebbistatina, un inhibidor de la miosina IIA (consulte la sección "Métodos"), y los comparamos con las simulaciones correspondientes, en en el que el efecto de la blebbistatina se imitó mediante una reducción de 10 veces la fuerza de tracción de las plaquetas. Las curvas cinéticas de contracción del coágulo experimental y simulada concuerdan cuantitativa y cualitativamente (Figura complementaria 11).

Por último, notamos que en las simulaciones de modelos, después de que se forman los grupos de plaquetas, surgen haces de fibrina de alta tensión que se forman entre grupos de plaquetas que tienen una escala espacial de decenas de micrones (Fig. 7 y películas complementarias 1 a 4). observado antes66. Las películas complementarias 1 a 4, la nota complementaria 4.5 y la figura complementaria 10 también demuestran la localización de la deformación en haces en simulaciones de modelos.

Configuración de coágulo simulada en \(t=0\) minutos (a) y t = 45 min (b), y un primer plano de los elementos del modelo a pequeña escala (c). Cada esfera grande representa el cuerpo de una plaqueta dentro de un coágulo esférico de radio inicial \(25\,{\rm {\mu m}}\), que comprende fibras de fibrina (líneas y pequeños subnódulos blancos en (c)) . Las pequeñas líneas verdes representan los filopodios y las pequeñas esferas verdes muestran el punto de conexión activa entre los filopodios y la fibrina. Las plaquetas de colores más cálidos ejercen más \(|{F}_{{{\rm {filópodo}}}}|\) total en la red circundante. Para una mejor visibilidad, los subnodos de fibra de fibrina individuales no se muestran en (a) y (b), pero las líneas dibujadas entre ellos están coloreadas por la tensión de la fibra desde la tensión baja (colores más fríos) hasta la tensión más alta (colores más cálidos). Además, para ayudar a observar la distribución de las plaquetas, en (a–d) se ha reducido la opacidad de las fibras de baja tensión. b muestra la aparición de haces de fibras de alta tensión. El panel c es un primer plano de varias plaquetas dentro del coágulo simulado y muestra subnódulos de fibrina individuales en blanco. Este panel demuestra la acumulación de fibrina en el cuerpo de las plaquetas. El panel d muestra una proyección en 2D de una vista lateral de un coágulo cortado digitalmente por la mitad, que muestra la distribución de la tensión interior localizada principalmente en haces entre grupos de plaquetas y fibrina comprimida adherida a las paredes de las plaquetas.

En diferentes condiciones, se ha demostrado que las plaquetas tienen distintos niveles de activación, lo que da como resultado más o menos filopodios por plaqueta67,68. El número de filopodios por plaqueta es un indicador de la activación plaquetaria en nuestro modelo que podemos controlar fácilmente. Para evaluar y cuantificar el impacto del número de filopodios individuales, se calculó la tasa de contracción del coágulo, además de las métricas presentadas en la subsección "Validación del modelo", durante 30 minutos de contracción en coágulos generados con números variables de filopodios por plaqueta. Todos los demás parámetros del modelo (Tabla 1) permanecieron fijos. La contracción del coágulo se simuló con el número de filopodios tomados de la distribución observada experimentalmente (Fig. 5). La distribución con un menor número de filopodios corresponde a un menor grado de activación plaquetaria. Por el contrario, la distribución con mayor número de filopodios corresponde a un mayor grado de activación plaquetaria67,68. La Figura 8 muestra los valores de resultado de las métricas presentadas en la sección anterior calculadas a partir de coágulos simulados para plaquetas con las distribuciones observadas experimentalmente de los números de filopodios, y en comparación con los números de filopodios derivados computacionalmente que son tanto más bajos como más altos que los valores experimentales (Fig. 8a-c).

Las simulaciones con números de filopodios intermedios observados experimentalmente se muestran mediante líneas continuas azules, mientras que las líneas discontinuas verdes y las líneas de puntos rojas representan simulaciones de la cinética de contracción del coágulo con los números de filopodios más bajos y más altos, respectivamente. Las regiones sombreadas representan el intervalo entre la media más una desviación estándar y la media menos una desviación estándar tomada de N = 10 coágulos simulados. a Área de fibrina colocalizada con plaquetas, b densidad de fibra y c cambios en la densidad de fibra a lo largo del tiempo (consulte también la Nota complementaria 4.2 y la Figura complementaria 5 para obtener detalles sobre los cálculos de las fases de contracción).

Las tasas y extensiones de la contracción del coágulo basadas en la densificación de la fibrina se correlacionaron con el grado de colocalización de la fibrina con las plaquetas. En las simulaciones, la densidad de la fibra aumenta aproximadamente un 10% en simulaciones con números de filopodios bajos (\(\mu =0.9\) y \(\sigma =0.19\)) y en más del 55% en simulaciones con números de filopodios altos ( \(\mu =3.7\) y \(\sigma =0.38\)), mientras que las plaquetas con el número intermedio de filopodios observado experimentalmente (\(\mu =1.85\),\(\sigma =0.27\)) causan ~ 30% de densificación (Fig. 8b). La Figura 8a muestra que en el curso de la contracción del coágulo, las plaquetas con los números de filopodios intermedios observados experimentalmente aumentan la cantidad de fibrina colocalizada en plaquetas 8 veces, mientras que las plaquetas con recuentos de filopodios bajos y altos logran un aumento de 5 y 10 veces. en la colocalización de fibrina, respectivamente. Por lo tanto, los resultados de la simulación (Fig. 8) revelaron que un aumento en la cantidad de filopodios por plaqueta resultó en una contracción más rápida del coágulo, más fibrina asociada a las plaquetas y una mayor densidad de fibras.

Sorprendentemente, los coágulos simulados que contenían plaquetas con los recuentos de filopodios observados experimentalmente tuvieron valores de métricas de contracción absoluta más cercanos a los observados en los experimentos16 (ver también Fig. 6), mientras que los coágulos simulados con números más bajos o más altos de filopodios por plaqueta se sometieron a una reducción o mejora. contracción, respectivamente, como se puede ver en la Fig. 8. Esta correlación proporciona otro argumento para la validación experimental del modelo aplicado para simular la cinética de la contracción del coágulo.

Por lo tanto, las simulaciones de modelos sugieren que el número de filopodios que se contraen por plaqueta es una característica importante que determina la cinética de fase de la contracción del coágulo y su complejidad biomecánica. Las plaquetas con un número reducido de filopodios contráctiles producen una contracción del coágulo alterada con una sola fase cinética, mientras que un aumento en el número de filopodios contráctiles por plaqueta conduce a una contracción del coágulo caracterizada por tres o más fases cinéticas, lo que refleja un mecanismo biomecánico más complejo del coágulo sanguíneo. contracción cuando las plaquetas están más activadas.

Anteriormente se ha demostrado16 que las distancias entre plaquetas en los coágulos en contracción se reducen progresivamente durante la contracción, lo que puede dar lugar a la formación de grupos de plaquetas secundarios que potencialmente pueden reforzar la contracción. Las simulaciones de modelos también demostraron la capacidad de las plaquetas para agruparse durante la contracción del coágulo de fibrina. Inicialmente, las plaquetas individuales se dispersaron uniformemente en un coágulo con una distancia interplaquetaria promedio de 25 µm. Como resultado de la densificación de la red de fibrina durante la contracción del coágulo, las plaquetas formaron grupos que constan de dos o más células (Fig. 9a). En 10 minutos de contracción del coágulo, la mayoría de las plaquetas se maclaron y posteriormente el número de cúmulos y su tamaño aumentaron progresivamente. Entre 10 y 30 minutos, la fracción promedio de grupos de dos plaquetas disminuyó, mientras que la fracción de grupos que contenían tres, cuatro, cinco y seis plaquetas aumentó en un 30%, 160%, 250% y 100%, respectivamente (Fig. 9b). Aproximadamente 40 minutos después del inicio de la contracción del coágulo, el número de plaquetas agrupadas superó la fracción de plaquetas individuales en el coágulo (Fig. 9a).

a Proporciones del número de plaquetas individuales (línea azul discontinua) y plaquetas en grupos (2 o más plaquetas, línea continua negra) durante la contracción del coágulo. Las líneas continuas representan valores medios, las áreas sombreadas indican la desviación estándar de la media, N = 10 simulaciones. b Histogramas del número de plaquetas por grupo, que contienen de 2 a 6 plaquetas formadas en coágulos simulados durante el transcurso de la contracción. Puntos de tiempo: 10 (azul), 20 (naranja), 30 (gris) y 40 (amarillo) minutos. c Histograma de la distribución de grupos de plaquetas a varias distancias normalizadas desde el centro (normalizado con respecto al radio del coágulo antes de la contracción) observado en la simulación. Puntos de tiempo: 10 (azul), 20 (naranja), 30 (gris) y 40 (amarillo) minutos.

La Figura 9c representa la frecuencia de los grupos de plaquetas con respecto a su distancia desde el centro del coágulo en los momentos t = 10, 20, 30 y 40 min desde el inicio de la contracción del coágulo. Por lo tanto, nuestras simulaciones predicen que los grupos se forman primero más cerca del borde del coágulo. En particular, los grupos de plaquetas son más frecuentes en dominios más alejados del centro y más cercanos al límite del coágulo (Nota complementaria 4.4 y Figuras complementarias 7 a 9 para obtener detalles adicionales). A medida que avanza la contracción del coágulo, las posiciones de los grupos se acercan al núcleo del coágulo (Fig. 9c), lo que refleja la contracción macroscópica del coágulo desde el borde hacia el centro. El resultado de esta simulación concuerda con la propagación del frente de contracción desde el límite hasta el centro del coágulo observada experimentalmente16,51.

Los modelos computacionales multiescala que describen interacciones entre células y matrices extracelulares y se calibran utilizando datos experimentales específicos desempeñan un papel importante en el estudio de la biomecánica de células y tejidos, así como del desarrollo embrionario y la invasión del cáncer69,70,71,72. En particular, se han desarrollado varios modelos teóricos y computacionales para simular las propiedades de la fibrina y la mecánica estructural de las redes de fibrina a diferentes escalas espaciales28,30,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82 ,83,84,85. En las referencias se describieron modelos mecánicos computacionales detallados de plaquetas y glóbulos rojos. 86,87. Además, la estabilidad de un coágulo en diferentes condiciones de flujo utilizando modelos multifásicos se estudió previamente en las referencias. 84,88,89,90.

Si bien la formación de coágulos sanguíneos se ha estudiado relativamente bien, se sabe poco sobre los mecanismos subyacentes a los complejos procesos posteriores de remodelación estructural y mecánica del coágulo llamados contracción o retracción, que son de gran importancia fisiopatológica. La contracción del coágulo es impulsada por plaquetas activadas que tiran de las fibras de fibrina, provocando una reducción en el volumen del coágulo. Los resultados obtenidos por Kim et al. 16 establecieron una base estructural cuantitativa para la mecanobiología de la contracción de los coágulos sanguíneos. Los coágulos de plasma rico en plaquetas humanos se examinaron experimentalmente en una variedad de escalas espaciales, con un enfoque particular en las interacciones entre plaquetas y fibras de fibrina y sus efectos sobre la cinética de contracción del coágulo a nivel macroscópico. En este artículo, las observaciones experimentales se complementaron y avanzaron mediante modelos computacionales multiescala para proporcionar importantes conocimientos mecanicistas sobre la contracción y remodelación estructural de los coágulos sanguíneos.

El marco de modelado multiescala para simular la contracción del coágulo, descrito en la Fig. 2, combina un submodelo a microescala del mecanismo de "tirar de una cuerda con las manos" de un filópodo que tira de una fibra de fibrina basándose en la rigidez de la fibra con un Submodelo de mesoescala de la red de fibrina. El modelo se validó utilizando datos experimentales específicos al demostrar tasas cinéticas similares de las fases "activas" de contracción tanto para experimentos como para simulaciones. Luego, las simulaciones de modelos cuantificaron con éxito la compactación/acumulación de fibrina cerca de plaquetas individuales y agregados de plaquetas. Además, en este artículo, variamos la cantidad de filopodios por plaqueta y predijimos cómo un mayor o menor número de filopodios por plaqueta podría influir en el proceso de contracción. Además, las simulaciones de modelos mostraron que la mayor parte de la tensión mecánica dentro de un coágulo que se contrae la experimentaban haces de fibras de fibrina que se extendían entre plaquetas individuales y/o sus grupos.

Para explicar correctamente la tasa de retracción de un solo filópodo, observamos que la maquinaria de actomiosina intraplaquetaria que genera las fuerzas de tracción requiere energía y depende fuertemente de ATP. Con el consumo de la reserva intracelular de ATP, la capacidad de las plaquetas para contraerse disminuye con el tiempo. El agotamiento natural de las plaquetas resulta en una disminución gradual y abolición de la contractilidad plaquetaria7. Otro mecanismo que restringe la contracción del coágulo es el endurecimiento gradual de la fibrina deformada, lo que hace que la fibrina que se contrae sea progresivamente resistente a las deformaciones inducidas por las plaquetas91. Tanto el agotamiento energético como el endurecimiento de la fibrina explican la meseta en la densificación de la red de fibrina. El modelo tiene en cuenta implícitamente la tasa de retracción de los filopodios al considerar la fuerza generada por los filopodios plaquetarios, que a su vez depende de la rigidez de la fibrina.

La razón de la alteración de la contracción del coágulo en condiciones (pro)trombóticas es la disfunción y el agotamiento plaquetarios, que es secundario a la activación plaquetaria continua3,4. Una de las principales consecuencias de dicho agotamiento es la refractariedad plaquetaria, es decir, la capacidad reducida para responder a un estímulo activador. El modelo captura esta situación estudiando plaquetas con diversos grados de activación, incluida la capacidad reducida de formar filopodios, que corresponde a la refractariedad parcial de las plaquetas.

Debido a que el grado de activación plaquetaria se correlaciona directamente con el número de filopodios plaquetarios, nuestros hallazgos sugieren que una activación plaquetaria débil da como resultado una contracción deficiente del coágulo. Esto es consistente con datos in vitro previos que muestran que la disminución en la concentración de trombina de 1 a 0,5 U/ml y, por lo tanto, el grado de activación plaquetaria, reduce el grado y la velocidad de contracción del coágulo41. Actualmente se desconoce la relación dinámica entre la concentración de agonista en un coágulo y el número de filopodios generados por una sola plaqueta. Quizás si en el futuro se desarrolla esa relación, nuestro modelo pueda ampliarse en consecuencia.

Las simulaciones de modelos con un número promedio de 6 a 7 filopodios por plaqueta reprodujeron las tres fases de contracción observadas en Kim et al. 16 con duración y tasas de densificación de fibrina similares. Además, las simulaciones de modelos predicen que un aumento en el número de filopodios a 12 da como resultado 4 fases, con mayores tasas de densificación de fibrina. Por otro lado, una disminución en el número de filopodios a 2-3 produjo una sola fase, con una menor tasa de densificación de fibrina. Un cambio en el número de fases significa un cambio en las tasas cinéticas de contracción. Como la contracción alterada del coágulo se ha asociado con la trombosis venosa profunda posoperatoria4, nuestros resultados complementan estos hallazgos y sugieren que la densificación de fibrina en los coágulos de estos pacientes con TVP podría reducirse significativamente. Mientras tanto, el número de fases cinéticas en pacientes con TVP no se modificó en comparación con el control sano, lo que señala el papel del agotamiento de las plaquetas en la contracción del coágulo alterada.

Las simulaciones de modelos también cuantificaron los impactos potenciales de diferentes niveles de dependencia de las fuerzas de tracción de los filopodios sobre la rigidez de las fibras, el tiempo de carga de estas fuerzas, así como la competencia por la actomiosina entre filopodios de la misma plaqueta (ver Fig. 2, Nota complementaria 4.3, Tabla complementaria 1 y Fig. 6 complementaria), sobre la tasa de cambio de la densidad de fibrina de un coágulo durante la contracción. También se demostró mediante el seguimiento de la agrupación de plaquetas en simulaciones que la formación de grupos de plaquetas era más prominente en los bordes al comienzo de la contracción y, posteriormente, estos grupos se movieron hacia el centro. Mecánicamente, las plaquetas en el borde de un coágulo experimentan una fuerza radial neta mayor que las plaquetas ubicadas más cerca del centro del coágulo. Como resultado, la velocidad radial de las plaquetas en el borde del coágulo es mayor que la de las plaquetas más cercanas al centro del coágulo. Este gradiente de velocidad radial de las plaquetas conduce a su agrupación en el borde del coágulo, ya que las plaquetas del borde superan a las plaquetas ubicadas más cerca del centro del coágulo durante el transcurso de la contracción.

En este estudio, se utilizaron 50 µl de plasma humano para generar un coágulo de tamaño mm para estudiar su contracción in vitro. Se adquirieron imágenes de coágulos en microscopía confocal de 120 × 120 × 35 μm durante la contracción del coágulo y se utilizaron para el análisis estructural. Al ejecutar simulaciones para aumentar progresivamente el tamaño del coágulo inicial y calcular el alcance final de la contracción, encontramos que los resultados no cambiaron significativamente cuando el radio inicial del coágulo alcanzó ~20 μm, lo que sugiere que el modelo es bastante escalable y los resultados son aplicables a coágulos a macroescala. Dado que la complejidad del modelo aumenta linealmente con el volumen del coágulo simulado, las simulaciones de coágulos más grandes son posibles una vez que se ha construido la arquitectura para simulaciones de múltiples GPU. Este marco de simulación está en desarrollo y puede usarse en el futuro para realizar estudios in silico en coágulos de orden mucho mayor.

El enfoque de modelado multiescala descrito en este artículo se puede utilizar para explorar más a fondo las propiedades del proceso de contracción que no se pueden medir fácilmente en experimentos (ver Fig. 2). Se sabe que algunas de estas propiedades dependen del lugar donde se formaron los coágulos (por ejemplo, diferentes orientaciones de las fibras en diferentes tipos de vasos sanguíneos, dependiendo de la velocidad de flujo) o de alteraciones en pacientes con patologías sanguíneas, como el síndrome de Bernard-Soulier, caracterizado por mutaciones en el complejo GPIb-IX-V, acompañadas de plaquetas inusualmente grandes, recuentos bajos de plaquetas y tiempo de sangrado prolongado, o algunas disfibrinogenemias congénitas caracterizadas por mutaciones del fibrinógeno que resultan en alteraciones en la estructura y propiedades de la fibrina. Siempre que se disponga de los datos correctos para estimar los valores de los parámetros, el modelo multiescala puede reproducir los coágulos formados en cualquiera de estos escenarios alternativos y los resultados de las simulaciones se pueden utilizar para predecir la contracción del coágulo. Esto podría ser especialmente útil para diseñar posibles estrategias de tratamiento farmacológico para algunos de los trastornos hemorrágicos o trombóticos que afectan la contracción del coágulo.

Observamos que el modelo actual no incluye glóbulos rojos que se sabe que desempeñan un papel importante en la formación y contracción de coágulos sanguíneos7,42. La contracción del coágulo da como resultado la deformación de los eritrocitos en células de forma poliédrica muy empaquetadas, poliedrocitos o piezocitos, formando una barrera impermeable importante para la hemostasia. Dado que el objetivo de este artículo es evaluar el mecanismo por el cual las plaquetas tiran de la red de fibras, excluimos los glóbulos rojos de nuestros experimentos y simulaciones para poder probar claramente la adhesión plaquetas-fibrina y las interacciones mecánicas. La interacción entre los eritrocitos y las fibras de fibrina es pasiva en el sentido de que no existe una fuerza contráctil inherente mensurable ejercida por los eritrocitos sobre la fibrina. Planeamos ampliar nuestro modelo multiescala en el futuro para incluir representación de glóbulos rojos, como los de la literatura92,93,94,95, así como nuestro submodelo multifase extendido96 para estudiar la contracción de coágulos sanguíneos con múltiples tipos de células.

Es bien sabido que las redes de fibras de fibrina formadas en condiciones de flujo97 tienen una estructura diferente a la de las formadas en condiciones estáticas. Sin embargo, las redes de fibras formadas en condiciones estáticas in vitro y en condiciones de flujo in vivo tienen mecanismos similares y grados comparables de contracción del coágulo98,99. Dado que los experimentos que utilizamos en este trabajo se realizan en condiciones estáticas (el número de Reynolds es \(\ll\)1), no incluimos explícitamente ecuaciones de flujo de fluidos en nuestro modelo. Sin embargo, explicamos la interacción del líquido de fibrina dentro del coágulo mediante la introducción de una fuerza amortiguadora viscosa y la fluctuación térmica de los nodos mediante la fuerza browniana. También observamos que los valores de los parámetros en el modelo actual son independientes del flujo sanguíneo. En el futuro, futuros desarrollos de modelos implicarán la ubicación y rigidez de los glóbulos rojos localizados en diferentes regiones del coágulo antes de la contracción para ver su impacto en la forma y el tamaño del coágulo; Obras como100 demuestran evidentemente que tales impactos son importantes. Estas simulaciones pueden proporcionar información sobre el impacto de la rigidez patológica de los glóbulos rojos en la contracción de los coágulos sanguíneos101, lo que sería difícil de estudiar in vivo o diseñar experimentos costosos de manera más eficiente. Alternativamente, ampliaremos nuestras ecuaciones de interacción entre fibrina y flujo sanguíneo para incluir una fuerza de deriva sesgada y proporcional a la proximidad de la fibrina a la superficie del coágulo, como se observa en la literatura39,96. Los estudios sobre los impactos del flujo sanguíneo en la contracción son difíciles y costosos en animales, y no posibles en seres humanos.

Finalmente, los mecanismos y el enfoque de modelado computacional descritos en este artículo también podrían aplicarse a otros sistemas en los que las células o partículas están incrustadas en una red de fibras y ejercen fuerzas sobre sus alrededores en función de la rigidez del sustrato u otras propiedades mecánicas. Por ejemplo, los fibroblastos reorganizan las redes de fibras compuestas de colágeno y elastina en las vías respiratorias asmáticas y sanas (es decir, órganos del tracto respiratorio que permiten el flujo de aire durante la ventilación). Otro ejemplo son las bacterias que interactúan con una red micótica y, por lo tanto, actúan de manera similar a las plaquetas en la red de fibrina.

Se extrajo sangre humana mediante punción venosa de voluntarios sanos que no habían tomado aspirina u otros medicamentos que afectaran la función plaquetaria durante al menos 14 días. El consentimiento informado se obtuvo siguiendo un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Pensilvania. Se preparó plasma rico en plaquetas (PRP) a partir de sangre completa extraída en citrato trisódico al 3,8% (9:1 v/v) mediante centrifugación a 210 xga 25 °C durante 15 min. Para marcar la fibrina y las plaquetas, las muestras de PRP se preincubaron con fibrinógeno humano marcado con Alexa-594 (9 µg/ml) y calceína (10 µg/ml), respectivamente, durante 10 minutos a 37 °C. Para inducir la coagulación y la contracción del coágulo, las muestras de PRP se recalcificaron con CaCl2 (29 mM) y se mezclaron con α-trombina humana (1 U/ml, todas las concentraciones finales). Se transfirió inmediatamente una muestra de plasma activado a la superficie de vidrio de un microscopio de una placa de cultivo celular PELCO dentro de la cámara ambiental de un microscopio confocal. La superficie del vidrio se recubrió previamente con Triton X-100 al 4 % (v/v) para evitar la unión de fibrina al vidrio y permitir la contracción sin restricciones del coágulo.

Se tomaron imágenes de los coágulos de PRP utilizando un microscopio confocal de barrido láser Zeiss LSM710 con una lente de inmersión en agua Plan Apo ×40 (NA1.2) para adquirir imágenes en serie en forma de z de 35 μm de espesor de los coágulos durante la contracción (40 min, en intervalos de tiempo de 75 s). La distancia entre cortes de las imágenes del apilamiento z fue de 0,8 µm; cada imagen fue tomada con una resolución de 1024 × 1024 píxeles. La fibrina y las plaquetas marcadas con fluorescencia se excitaron utilizando rayos láser de helio-neón (fibrina) de 594 nm y argón (plaquetas) de 488 nm y se visualizaron en longitudes de onda de emisión de 620 nm (rojo) y 515 nm (verde), respectivamente. La reconstrucción 3D de la malla de fibrina-plaquetas se realizó utilizando el software Imaris. El número de filopodios formados por plaquetas individuales se midió manualmente en las pilas z de microscopía confocal adquiridas de coágulos de PRP en contracción utilizando el software de código abierto Fiji. Para calcular el número de filopodios, cada imagen se dividió en 50 dominios cuadrados de pilas en z de 10 µm de espesor y se contó el número de filopodios para cada plaqueta individual. Para rastrear los cambios en la intensidad de la fluorescencia de la fibrina, la densidad de la red de fibrina y la colocalización de las plaquetas con fibrina, se postprocesaron imágenes en serie de microscopía confocal en forma de pila z recopiladas durante la contracción del coágulo utilizando el software de Fiji y se cuantificaron utilizando herramientas de análisis de imágenes estándar de Fiji16,102,103.

El plasma rico en plaquetas (PRP) se obtuvo mediante centrifugación de sangre entera citratada a 200 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las muestras de PRP se preincubaron sin y con blebbistatina (concentración final de 200 µM) durante 3 minutos a 37 °C. Los cambios en el tamaño de los coágulos se rastrearon ópticamente a lo largo del tiempo como se describió anteriormente41. Los coágulos de plasma se formaron en cubetas de plástico cuyas paredes estaban prelubricadas con pluronic F-127 al 1% (Sigma-Aldrich) para evitar que la fibrina se pegara. Para iniciar la formación del coágulo, en un tubo de plástico separado se recalcificó PRP citrado con CaCl2 2 mM seguido de la adición de 1 U/ml de trombina (ambas concentraciones finales). Para la formación y contracción de coágulos, se transfirieron muestras de 80 μl a cubetas de plástico transparente de las que se tomaron imágenes utilizando un instrumento óptico equipado con una cámara CCD. Los cambios en el tamaño del coágulo durante la contracción se siguieron mediante la adquisición de imágenes cada 30 s durante 30 min. Las secuencias de imágenes se analizaron computacionalmente para trazar curvas cinéticas de contracción y medir el alcance final de la contracción.

Los valores de los parámetros utilizados en el modelo se dan en la Tabla 1. Para obtener una red de fibrina virtual con propiedades tanto cuantitativa como cualitativamente similares a las observadas en los coágulos de plasma rico en plaquetas experimentales, desarrollamos un algoritmo para generar un algoritmo computacional de tres Coágulo dimensional formado por plaquetas y fibras de fibrina. Esta rutina utiliza medidas cuantitativas extraídas de imágenes de microscopía confocal de fibrina pura27,29 o coágulos de plasma27,29, como la distribución de la longitud de las fibras, la orientación de las fibras y las densidades de las fibras. Estas cantidades y las estructuras de los coágulos son fundamentales para la correcta dinámica de contracción biológicamente relevante en los coágulos sanguíneos. (El algoritmo y los detalles de su aplicación se describen en la Nota complementaria 2.1).

Se realizaron y analizaron estadísticamente simulaciones de 10 coágulos in silico generados independientemente compuestos de fibrina y plaquetas activadas. Esto se hizo para la validación del modelo y la verificación de la predicción del modelo. Utilizamos curvas polinómicas de 3 grados para ajustar diferentes conjuntos de datos en la Nota complementaria 3 realizando una rutina de optimización de mínimos cuadrados no lineal de la biblioteca SciPy Python104. Los errores (indicados por segmentos sombreados, consulte las figuras 7 y 8 en el texto principal y las figuras complementarias 4 a 6) se calcularon utilizando desviaciones estándar en cada coeficiente polinómico de ajuste dado por \({\sigma }_{i}=\ sqrt{{{\rm {co}{v}}}_{{ii}}}\) donde \({\rm {{co}{v}}}_{{ii}}\) es el elemento diagonal de la matriz de covarianza calculada de los valores optimizados de los coeficientes estimados.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos de respaldo relevantes están disponibles en el siguiente repositorio de CodeOcean: https://codeocean.com/capsule/4c7bb411-62de-47de-93b4-2c03441d6338/. Los datos para este estudio se generaron con los algoritmos de simulación descritos en el artículo y el código fuente depositado en la cápsula CodeOcean. Las instrucciones para compilar el código fuente y ejecutar simulaciones para reproducir los resultados presentados en el artículo se encuentran en el archivo README.

El código fuente, los scripts de entrada, los archivos Python de posprocesamiento y los archivos README están disponibles en la cápsula CodeOcean: https://codeocean.com/capsule/4c7bb411-62de-47de-93b4-2c03441d6338/.

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Este trabajo fue parcialmente financiado por la subvención NIH no. UO1 HL116330 (SX, ZX, OVK, RIL, JWW, MA), R01 HL146373, HL148227 (JWW, RIL), Beca de la Fundación de Investigación de la Universidad de Pensilvania (JWW), subvenciones NSF DMS-2029814 (MA, SB) y DMS-1517293 y NSF-CDS&E-203451 (ZX), subvención 17SDG33680177 de la American Heart Association y subvención NIH R21DE030294 (OVK). MA también recibió apoyo parcial de la subvención NSF DMS 2029814. Este trabajo también fue respaldado en parte por los premios NSF CNS-1730158, ACI-1540112, ACI-1541349, OAC-1826967, la Oficina del Presidente de la Universidad de California y la Universidad. del Instituto de Telecomunicaciones y Tecnología de la Información de California de San Diego/Instituto Qualcomm. También queremos agradecer el apoyo del CENIC para el acceso a las redes de 100 Gbps. Los cálculos se realizaron utilizando los grupos de computadoras y los recursos de almacenamiento de datos del UC Riverside HPCC, que fueron financiados parcialmente por la subvención NSF MRI-2215705.

Estos autores contribuyeron igualmente: Christian Michael, Francesco Pancaldi.

Departamento de Matemáticas, Universidad de California Riverside, Riverside, CA, 92521, EE. UU.

Christian Michael, Francesco Pancaldi, Samuel Britton, Khoi Vo y Mark Alber

Centro de Modelado Cuantitativo en Biología, Universidad de California Riverside, Riverside, CA, 92521, EE. UU.

Christian Michael, Francesco Pancaldi, Samuel Britton, Khoi Vo y Mark Alber

Departamento de Microbiología e Inmunología, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, 48109, EE. UU.

cristian miguel

Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Facultad de Medicina de la Universidad de Pensilvania, Filadelfia, PA, 19104, EE. UU.

Oleg V. Kim, Rustem I. Litvinov y John W. Weisel

Departamento de Ingeniería y Mecánica Biomédica, Centro de Materia Blanda y Física Biológica, Virginia Tech, Blacksburg, VA, 24061, EE. UU.

Oleg V.Kim

Departamento de Farmacología, Facultad de Medicina de la Universidad de Pensilvania, Filadelfia, PA, 19104, EE. UU.

Alina D. Peshkova

Departamento de Estadística y Matemáticas Aplicadas y Computacionales, Universidad de Notre Dame, Notre Dame, IN, 46556, EE. UU.

Zhiliang Xu

Departamento de Bioingeniería, Universidad de California Riverside, Riverside, CA, 92521, EE. UU.

Marcos Alber

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MA, FP, CM, OVK, RIL y JWW conceptualizaron el trabajo. SB, ZX, FP, CM, OVK y MA desarrollaron el modelo computacional. La adquisición de datos experimentales fue realizada por OVK y ADP El análisis formal fue realizado por OVK, AP, CM, FP, KV y RIL Las simulaciones del modelo fueron ejecutadas e interpretadas por CM, FP, OVK, ZX, RIL, JWW y MA Los recursos fueron proporcionados por MA y JWW Todos los autores contribuyeron a escribir borradores originales y revisados. La administración del proyecto fue supervisada por MA, OVK y JWW.

Correspondencia a John W. Weisel o Mark Alber.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Este manuscrito ha sido revisado previamente en otra revista de Nature Portfolio. El manuscrito se consideró apto para publicación sin revisión adicional en Communications Biology. Editor principal: Gene Chong.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Michael, C., Pancaldi, F., Britton, S. et al. Modelado computacional combinado y estudio experimental de los mecanismos biomecánicos de la contracción de coágulos de fibrina impulsada por plaquetas. Común Biol 6, 869 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05240-z

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Recibido: 14 de junio de 2023

Aceptado: 10 de agosto de 2023

Publicado: 24 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05240-z

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